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胡萝卜(Daucus carota)抗冻蛋白基因的克隆及其对番茄(Lycopersicon esculentum)的转化

尹明安

  许多农作物,尤其是一些果品和蔬菜,不仅在田间栽培过程中,而且在收获后的冷藏、冻藏和速冻加工过程中都会遇到冷冻伤害。然而,用常规的育种方法来改良作物的抗寒性会遇到许多困难。随着分子生物学的发展,基因克隆技术逐步介入植物抗寒研究,而率先进入该领域的基因即为极区鱼类抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs)基因(afp)。自二十世纪80年代,鱼类的afp结构被研究清楚以后,人们先后将其afp转入郁金香、烟草、油菜、玉米、番茄、马铃薯等作物,力图提高这些作物的抗寒性,取得了一些有益的结果,但离人们的期望还相差较远。1998年10月英国York大学的Dawn Worrall等发表了胡萝卜AFP及其基因的论文,标志着第一个植物afp基因的发现,对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。他们不仅测定了胡萝卜AFP的体外热滞值及重结晶抑制活性,而且将其cDNA连接在表达载体的双CaMV 35S启动子之后导入烟草,获得了正确表达。本研究用PCR的方法克隆了胡萝卜afp,构建了其植物表达载体,并用农杆菌介导法将其导入番茄之中,初步获得了转化植株。以英国胡萝卜变种var. autumn King,中国胡萝卜变种var. sativus Hoffm Deutschl的3个地方品种——宁夏吴忠胡萝卜、陕西华县胡萝卜和陕西汉中胡萝卜为材料,用PCR方法克隆了抗冻蛋白基因afp,发现afp在所试材料中普遍存在。用宁夏吴忠胡萝卜的afp核苷酸序列和英国胡萝卜var. autumn King的afp进行了对比,在所测1004个核苷酸中,有35个碱基不同,其中无义突变20个,有义突变15个,按有义突变计,同源性为98.5%。以克隆到的var. autumn King的afp为目的基因,以pUC_m-T Vector为载体,构建成胡萝卜afp的克隆载体pTAF。用EcoRI消化重组质粒pTAF使其线性化,再用DNA聚合酶ⅠKlenow大片段补平末端,然后用XbaⅠ消化,获得一末端粘,一末端平的目的片段(afp)。植物表达载体pBI121用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切,获得一末端粘,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在T_4DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成胡萝卜afp的植物表达载体pBAF。用直接转化法将重组子pBAF导入根癌农杆菌LBA4404。以番茄‘ZF’的子叶和下胚轴作为外植体,对细胞分裂素与生长素的7个组合进行了比较试验,确定MS+BA 1.0mg/L+IAA 0.2mg/L为最佳生芽培养基。最佳生根培养基为MS+IAA 0.05mg/L。番茄无菌苗出芽后5——7天,子叶切成0.scm X 05cm片段,下胚轴切成Icm节段,于生芽培养基26℃260o LW预培养24h。农杆菌LBA4404过夜培养,用Ms培养液稀释10——20倍,侵染外植体smin,28 ’C黑暗共培养48h。然后在MS+BAl刀mg/L+IAA 0.Zot+Kan 25mg/L+cef 200mg/L筛选培养基上诱芽,每两周转接 1次。芽长至Zcm时,切下转至*S+M人0刀smN+Kan 12.sin叭Ce门伽恤叭培养基上生根。到目前为止,877个外植体共获得不定芽221个,已转至生根培养基上80个,获得生根幼苗12株,对IO株生根幼苗进行了PCR检测,其中2株呈阳性,初步证明胡萝卜吻基因已经导入该两株番茄体内。……   
[关键词]:胡萝卜;抗冻蛋白基因;克隆;测序;载体构建;农杆菌;遗传转化;组织培养;番茄
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2001年