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人肺腺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆与初步鉴定

陈杰

  肺癌细胞的多药耐药(MDR)是药物治疗失败的重要原因,突破多药耐药障碍,提高药物治疗肺癌的效果,是肺癌基础和临床研究的重点。目前与肺癌多药耐药有关的机制主要有以下几个方面:1.发生在细胞膜水平的药物摄取减少和外排增多,引起细胞内药物的绝对浓度降低,如由P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)引起得耐药。2.发生在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变,使药物无法接近起作用靶点,引起药物有效浓度降低,如由多药耐药相关蛋白(MRP)引起的耐药。3.肺耐药相关蛋白(LRP)对化疗药物的胞吐作用。4.乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的耐药。但是,有研究表明一些肺癌耐药表型并不表达P-gp、MRP、和LRP,经典的多药耐药路径难以圆满解释这种现象,提示肺癌耐药性的形成可能另外的机制,因此我们认为,随着分子生物学和相关学科的飞速发展,基因克隆策略和技术的不断更新,利用有效的基因克隆技术,发现新的肺癌多药耐药相关基因已成为可能。本研究采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方式,以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系SPC-A-1为诱导对象,经过192d的诱导,建立了人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP。MTT结果表明该细胞系对顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱、和足叶乙甙等药物有不同程度的耐药性。生长曲线、倍增时间、形态学和常规染色体检测显示SPC-A-1/CDDP细胞性状稳定,是可靠的人肺腺癌多药耐药细胞系,可应用于下游实验,同时提示大剂量冲击和逐步增加剂量相结合可缩短药物诱导时间。在成功诱导建立肺腺癌多药耐药细胞系的基础上,应用抑制消减杂交(SSH),以肺腺癌多药耐药细胞SPC-1-A/CDDP cDNA为实验方(Tester),以肺腺癌细胞 SPC刁 CDNA为对照方①),结合 T/A克隆技术构建了肺腺癌多药耐药细胞差异表达消减CDNA文库,经斑点杂交筛选获得21个SPC-A4/CDDP细胞差异表达CDNA片段。测序和同源性分析表明16个CDNA片段与已知基因有93%叫%的同源性,2个CDNA片段为新序列(分别为 337hP牙 494hP),在 GenBank中末发现同源性,可能代表了某个新基因序列,Northern杂交验证结果表明。DNA片段在SPC-AJ/CDDP细胞上高表达,为肺腺癌多药耐药细胞差异表达cDNA片段。我们的研究表明SSH技术是筛选新基因的有效方法,2个新的CDNA片段是寻找肺腺癌多药耐药相关基因的良好候选者,对其功能的进一步研究,有利于从另外一个角度了解肺癌多药耐药形成的机制。……   
[关键词]:人肺腺癌细胞;多药耐药;多药耐药相关基因;抑制消减杂 交;DNA测序
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第三军医大学2001年