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多重超强耐药大肠杆菌耐氟喹诺酮质粒及gyrA基因的研究

雷连成

  氟喹诺酮药物(即第三代喹诺酮类药物)自1978年发现以来由于其疗效显著得到了国内外的广泛重视。但是细菌对氟喹诺酮类药物极易产生耐药性,而且传播广泛、迅速,据推测,氟喹诺酮药物的抗性质粒可能是耐药性传递的重要因素之一,但是在耐药机制复杂、对氟喹诺酮类耐药率极高的大肠杆菌中尚未报道有此类质粒的存在。本课题以研究大肠杆菌对氟喹诺酮等常用药物的耐药现状为基础,以危害严重的多重、超强耐药大肠杆菌为研究对象,研究了氟喹诺酮抗性质粒及其与染色体gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变共同作用的耐药机制。1996年10月至1999年月4月分离鉴定了146株动物源性致病性大肠杆菌,采用Kinby-Bayer(KB)琼脂弥散法测定对18种抗生素的耐药性,测定标准按美国NCCLS标准。结果最少耐药3种,最多耐药15种,其中对氟喹诺酮的耐药率猪源大肠杆菌为56%,鸡源大肠杆菌为20.5%。筛选出32株以氟喹诺酮耐药为主的多重耐药大肠杆菌,质粒提取、纯化后转化DH5α、JM109大肠杆菌感受态,进行转化,用含20μg/ml OFL的LB平板筛选转化子,在菌株CE01质粒获得转化子。EB、BS作为耐药性消除剂对32株耐氟喹诺酮药物的致病性大肠杆菌分别处理24h,48h,其中4株对氟喹诺酮的耐药水平明显降低,提取其质粒进行电泳检测,结果只有大肠杆菌CE01在转化试验中可随氟喹诺酮抗性转移的质粒带随耐药水平的降低而减弱或消失,其余3株耐药水平降低的菌株质粒带无变化。用聚合酶链式反应(PCR)扩增CE01菌株gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR),质粒DNA和染色体DNA均可扩增出长度为668bp的DNA片段。经测序分析,两者基因序列相同率为98.17%。与基因数据库Swanberg,S.L.and Wang,J.C.报告的大肠杆菌gyrA基因相应序列比较,该菌质粒DNA PCR产物同源率97.8%,有13个位点发生突变,3个氨基酸被替换;染色体DNA PCR产物同源率98.00%,有12个位点发生突变,2个氨基酸被替换。放射性同位素α-~(32)P分别标记CE01菌株染色体DNA和质粒DNA的PCR扩增片段制成探针,用DNA斑点杂交法对CE01菌株进行检测。质粒DNA和染色体DNA分别与质粒探针和染色体探针杂交出现典型的阳性杂交斑。将CE01菌株质粒DNA于0.7%琼脂糖凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜,采用奶粉杂交体系与α-~(32)P标记的CE01菌株质粒DNA的PCR扩增片段进行Southern杂交,CE01菌株质粒谱中可随氟喹诺酮抗性转移的质粒带与质粒探针出现杂交阳性。证实CE01菌株含有氟喹诺多重迟强耐荷大肠抨官耐派喳话酮质粒及gw篡因的研宠中文折昙酮抗性质粒,并在质粒和染色体上同时存在耐喳诺酮gyrA突变基因,该菌对氧氟沙星高水平耐药是质粒介导和染色体突变共同作用的结果。……   
[关键词]:大肠杆菌;氟喹诺酮;gyrA 基因;耐药质粒
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军需大学2001年