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新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究

丁壮

  从我国部分地区分离、鉴定了23株新城疫病毒(NDV),并对其部分生物学特性进行了研究。这23株NDV均能凝集鸡和人(O型血)的红细胞,对猪、山羊、绵羊、牛和马的红细胞凝集作用有差异。分离、鉴定的23株NDV,电镜下呈现圆形或椭圆形,直径100-500nm,囊膜上有长约8-10nm的纤突。NDV分离株及F_(48)E_8经鸡胚成纤维细胞培养,形成稳定的病毒蚀斑。血凝解脱及血凝素热稳定试验表明,四平株、昌黎株、青岛株和F_(48)E_8为快速解脱型,血凝素热稳定性差,而长春株为慢速解脱型,血凝素热稳定性好。鸡胚平均致死时间(Mean Death Time of chicken embryos,MDT)、脑内致病指数(Intracerebral Pathogenicity Index,ICPI)和静脉致病指数(IntravenousPathogenicity Index,IVPI)的检测结果表明,长春株是弱毒株(MDT大于168h、ICPI为0.25、IVPI为0),四平株(MDT为61.2h、ICPI为1.45、IVPI为1.96)、昌黎株(MDT为64.5h、ICPI为1.45、IVPI为2.48)是中强毒株,青岛株(MDT为57.9h、ICPI为1.65、IVPI为2.75)为强毒株。参考有关文献,设计并合成了一对特异引物。应用RT-PCR,一次性扩增了NDV四平株、昌黎株、青岛株、长春株和F_(48)E_8(国家标准NDV强毒)的全长HN基因。扩出的四平株、昌黎株、青岛株和F_(48)E_8HN基因均为1713bp,编码571个氨基酸,其中四平株和F_(48)E_8HN基因有5个糖基化位点,青岛株和昌黎株HN基因有6个糖基化位点,四平株有12个半胱氨酸残基,而昌黎株、青岛株和F_(48)E_8HN基因含有13个半胱氨酸残基。从同源性分析和系统发育进化树结果来看,野生毒四平株、青岛株、昌黎株与F_(48)E_8相比较,氨基酸序列同源性分别为98.8%、89.7%、89.8%,而国外强毒株Tex.GB、Miyadera、Italien与标准强毒F_(48)E_8氨基酸序列同源性分别为87.6%、90.9%、91.1%,说明国外强毒株与国内标准强毒株在HN基因上同源性并不是很高,而国内分离毒四平株与F_(48)E_8在HN基因上有非常高的同源性,而青岛株、昌黎株与四平株比较,与F_(48)E_8相差近10个百分点,说明国内不同地区的NDV分离株HN基因的同源性相差是很大的,用一种或两种标准强毒制成的疫苗用于防制新城疫难免会出现免疫学上的偏差,而用国内不同地区分离的、同源性不一致的、以基因Ⅶ型为主、辅以Ⅷ型及老基因型(Ⅰ~Ⅵ)、加上我的特有的基因Ⅸ型新城疫病毒HNffi白基因的克降、序列分析、表达及其免疫原件叭究怕NDVF。止卜F。术。等)流行毒株制成的NDV多价灭活苗代替国外进 L]的灭活油苗来防制我国鸡新城疫的发生可能会更有针对性,防制效果会更好。长春株HN基因为173fop,编码577个氨基酸,有5个糖基化位点,门个半脱氨酸残基,NDV长春株与 Lasota、Queensland V4、D26厂6和 UlSter %弱毒株的HN基因的氨基酸同源性在 98.8%~93.4%,系统发育进化树也协J川\非常近的亲缘关系。王兴龙等研究表明,**V长春株F基因裂解位点区门门-117)的氨基酸组成为Gly-Arg-Gin-GlyArg*eu,与所有弱毒株在这一区域的序列Gly,Arg/Lys-Gin-Gly/Ser-Afg-Leu十符。由此更进一步证实长春株为弱毒株。我国目前还没有研究低毒力**V弱毒株的报道,此弱毒株的发现将为我的研制自己的弱毒疫苗提供疫苗候选株。将 NDV四平株和长春株 IIN基因亚克隆进入 pFastBac,构建了重组转座载体phst HN,通过转座得到了重组表达载体pBacmid HN,后者转染昆虫细胞后产生重组杆状病毒。重组杆状病毒在昆虫细胞中成功地表达了u蛋白。经SDS-PAGE和Western七*检测,表达的HN蛋白分子量为74kDa川。昆虫细胞内糖基化X 还有一个67kDa的小蛋白(未糖基化X 与国外报道结来致。NDV四平株,青岛株,昌黎株,长春株和NDV F化止;株重组 HN蛋白二倍连续稀释后,按6一微量法测定血凝效价,结果HA值分别为2‘、2‘、2‘’、2’、2‘,应用抗NDV HN单克隆抗体做血凝抑制试验,HI效价分别为2‘、2’、2’、2’、2’。结果表明,表达的重组HN蛋白均具有良好的血凝活性,1{这种血凝活性能够被抗NDV单抗所中和。用NDV四平株和长春株表达的HN重组蛋白分别免疫15H龄雏鸡,免疫两次,间隔两周。免疫剂量为600U令只,第一次加弗氏亢全佐剂,第 欣加弗氏不完全佐剂。同时设新城疫V4油苗对照组和 F。术s攻毒组。统计临床发病与兔疫保护情况,用间接ELISA检测抗HN蛋白抗体效价,用HA爿 检测血凝抑制抗体效价。结果表明,F。术s攻毒组20只鸡经过4天的潜伏期后,全部发病,8天内全部死亡,油苗对照组20只鸡全部存活,四平株HN r……   
[关键词]:新城疫病毒(NDV);HN基因;RT-PCR;序列分析;Bac to Bac系统;表达;免疫原性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国人民解放军军需大学2001年