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番茄乙烯受体基因LeETR1和LeETR2的分子生物学研究

郑铁松

  乙烯是调控植物生长发育的一种重要激素,植物内源乙烯的生物合成、信号转导和生物效应的调控研究一直是一个热门课题。乙烯生物合成的途径已经阐明,而乙烯信号转导系统的研究则刚刚起步,且主要集中在拟南芥上。但拟南芥无法作为果实尤真是呼吸跃变型果实(如番茄)的成熟模型。本课题在克隆番茄乙烯受体基因LeETR1和LeETR2部分特异序列的基础上,首次将乙烯受体基因LeETR1 mRNA和LeETR2 mRNA的表达和反义抑制结合起来研究,使研究的结果能够比较全面地反映LeETR1和LeETR2的功能特性。主要结果如下:1.采用RT-PCR从番茄组织总RNA中克隆了LeETR1和LeETR2的3’-端部分序列,所克隆的LeETR1和LeETR2 cDNA的长度分别为313bP和265bp。通过序列测定证明与文献报导的相同。以克隆的DNA序列为探针进行LeETR1 mRNA和LeETR2 mRNA表达的核酸酶保护分析(RPA)时,分别只产生单一的特异带,说明克隆的DNA序列具有高度特异性。2.采用RPA方法对番茄乙烯过表达单基因突变体Epi和野生型VFN8中LeETR1 mRNA表达特征的研究表明,在正常番茄中LeETR1 mRNA不受内源乙烯含量的影响,呈组成型表达。LeETR1 mRNA在Epi部分组织中的表达强度发生了改变,这些表达强度的改变与Epi的形态特征变化相吻合,提示LeETR1在叶片的形态建成和果实成熟中可能起着重要的作用。3.采用RPA方法对番茄乙烯过表达单基因突变体Epi和野生型VFN8中LeETR2 mRNA表达特征的研究表明,在所有被检组织中LeETR2 mRNA均表达。真表达丰度在叶组织中呈发育调节模式,但不受内源乙烯含量的影响;而在果实成熟后期受乙烯的轻微诱导。LeETR2的这种表达模式明显有别于其他乙烯受体基因。实验结果提示LeETR1、LeETR2和已知的诱导型乙烯受体LeETR3(NR)可能分属不同的乙烯受体系统,它们在番茄乙烯信号转导中起着不同的作用。4.我们以不同番茄品种(9551、T9253、Estrella、9209、B1)的子叶为外植体,以附加适当配比BA和IAA的改良MS培养基(MS无机组分+B5有机组分)为分化培养基,以不加激素的改良MS培养基为生根培养基,建立了具有高效芽再生和生根频率的番茄再生体系。番茄品种9551、T9253、Estrella、9209和B1的最适分化培养基上附加的激素分别为BAZ.sing几n刀m叭、BAZ刀mg/L+IAAO.Zing/L、BAZ.smgiL+IAAO.4mg/L、BAZ刀mg/L+IAAO.4mg/L、BAZ.sing/L0.4mg/L;在最适培养基上它们的芽分化频率分别为92.4%、88.5%、gi石%、89.2%和94.1%。5.外植体尤其是下胚轴外植休的放置方式对分化频率有明显的影响。采用下胚轴作外植体时,一定要正向放置,否则苗再生的频率会严重下降。6.番茄品种 9551、T9253、Estrella、9209和 BI对卡那霉素(Xill)的敏感性不同。9551、T9253、Estrella和 9209在附加 25mg/L loll的培养基上其分化即完全受抑制,而抑制番茄BI的再生则需要附加100mg/Lloll。7.以中间表达载体pPZPll IA为基础,以克隆的乙烯受体基因LeETRIfDLeETRZ的特异序列为目的插入DNA,构建了反义表达载体pPZPEI和 pPZPEZ。通过PCR和酶切验证,表明 LeETRI和 LeETRZ的反义表达载体己经构建成功,并己转入农杆茵中,为下一步的番茄转基因研究奠定了基础。8.以7-9 日龄的番茄BI无菌苗子叶为外植体,根癌农杆菌LBA4404OPZPEI)、LBA4404OPZPEZ)、EHA105toPZPEI)%D EHA105 toPZPEZ)为介导,采用叶盘转化法进行了反义LeETRI和反义LeETRZ的遗传转化研究。在筛选压力为Km 100mg/L的分化培养基和筛选压力为 M 50mg/L的生根培养基上,2种反义转基因番茄各获得了082%和0.91%的阳性转化苗再生频率:通过PCR和Southernblot的结果证明,己经获得了反义LeETRI和反义LeETRZ的转基因番而檀株。亲代的转基因番茄目前在温室中生长良好。同时在进行遗传转化的过程中,我们也对农杆菌的类型、农杆茵的浸染方式、共培养及预培养时间等多种因素对转化效率的影响进行了研究。证明LBA4404和E皿105都可有效地进行番茄的遗传转化9.对亲代转基因番茄生长特性的初步研究表明,两种转化植株都表现出了一定的抗裹老特性,但初步观察真结果率低于末转化番茄。转化番茄与对照相比在生长特性上的这些差异,预示着乙烯受体基因LETR!和LETRZ与番茄的叶片生长和果实发育过程相夫,这一结果与我们前面对LeETRI tnRNA和LeETRZ m洲A表达特性的研究结果相吻台。提示与诱导型的乙烯受体LeETR3(NR不同,LeETRI和……   
[关键词]:番茄;乙烯受体;LeETR1;LeETR2;反义基因;遗传转化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2001年