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人表皮生长因子工艺的应用基础研究

童望宇

  分离是导致生物技术产品价格高昂的主要原因。提高发酵目标产物的产量、降低发酵液中的杂质含量与扩大目标产物和杂质间的理化性质差异是降低分离成本的有力措施。发酵与分离过程的相互兼容,有机结合(集成)将是降低生产成本的有效途径。基于此原则,本文对生物技术产品hEGF的生产进行了研究。实验考察了理化因素对工程菌生长的影响,特别是发酵培养条件对人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)产量和发酵液组成的影响,同时对摇瓶发酵的动力学进行了初步探讨,结果表明:(1)氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)浓度的增加对工程菌的生长有一定的抑制作用;异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)对工程菌生长的影响较小;接种量的减少导致延滞期增长。(2)根据正交实验极差分析结果,各因素影响对产量的影响作用大小为:接种量>Amp浓度>IPTG浓度>胰蛋白陈(trypton,try)与酪蛋白酸水解物(casein,cas)之比>葡萄糖(glucose,glu)与乳糖(lactose,lac)之比。(3)优化培养基组成为:接种量1%,IPTG浓度0.3mM,Amp浓度150mg/L,lac:glu 5:0(总量为5g/L),Try:Cas为1:1(总量为40g/L)。在此优化条件下,hEGF的产量从213.4mg/l提高到242mg/l,特别是发酵培养基中用乳糖替代葡萄糖,其发酵液中的杂蛋白质浓度显著下降,为纯化分离提供了有利条件。(4)通过对该发酵体系的分析,建立描述该过程的发酵动力学模型,由计算结果与实验结果的比较可知,该动力学模型基本上反映了重组E.coli发酵hEGF过程的规律,特别是在描述菌体生长上,比较准确。考察了用STREAMLINE-DEAE阴离子交换剂以填充床模式在AKTAExplore100进行hEGF的初步浓缩分离,各种操作条件对纯化过程的影响进行了系统研究,结果表明:(1)hEGF保留体积随线性流速、进样体积、柱床高度、梯度长度及pH的增加而增加,但保留体积的增加值等于进样体积的增加量,此外进样浓度的改变基本不改变其保留体积。回收峰面积%随进样体积、进样浓度及梯度长度的增加而下降,随柱床高度及pH值的增加而增加,且线性流速的改变基本不改变其回收峰面积%。容量因子随线性流速、进样体积、柱床高度、梯度长度及Ph值的增加而加大;但进样浓度对容量因子影响浙江大学博土学位论文摘要甚小。峰宽随线性流速、进样体积、柱床高度、梯度长度、pH及进样浓度的增加而上升。但由于进样体积与进样浓度的大量增加仅引起峰宽的少量加大,故适当加大进样体积与进样浓度可提高产品浓缩效率和产品的生产率。Q)初步优化的分离条件为:线性流速为150cln/h,进样体积为50ml,柱床高度为11.3cm,洗脱液为含 2M NaCI的 0乃2M的磷酸盐缓冲液…H7刀),洗脱梯度为ZCV(柱体积)。在此条件下,hEGF的浓缩倍数达2.9,回收率达85%,纯度达10%以上。故 STREAMLINE DEAE以填充床模式分离高附加值产品hEGF是完全可行的。另外,研究表明,采用累加进样方法,能够扩大柱的吸附容量,并可节省操作时间提高分离效率,也是一种比较可行的方法。考察了用ST肪AMLffeE-DEAE阴离子交换剂以扩张床模式对hEGF进行初步浓缩纯化,研究了多种操作条件对分离过程的影响,结果表明:()线性流速、进样体积、梯度长度、样品浓度及 pH对 hEGF保留体积、回收峰面积%、容量因子、峰宽等有不同的影响,而其影晌趋势常与填充床趋势相似,说明扩张床与填充床有相似的分离机理。(二)初步优化的分离条件为:线性进样流速为183ctn/h,线性洗脱流速为37 c1Ylul,进样体积为300 ml,柱床高度为 13.8 cm,洗脱液为含2 M NaCI的0.02 M的磷酸盐缓冲液巾H7刀),洗脱梯度为ICV(柱体积)。在此条件下,hEGF的浓缩倍数达4.3,回收率达80%,纯度达20%以上。从hEGF的扩张床分离与填充床分高的优化结果发现,其产品的纯度、浓缩倍数及生产能力都有较大提高,故STngAMLINE DEAE以扩张床模式分离高附加值产品hEGF具有较好的效果。考察了不同的线性流速、进样体积与柱床高度对hEGF在凝胶层析中的分离特性和样品组分间分离度的影响。结论如下:门)hEGF的保留体积具有流速依赖性,hEGF的分配系数随线性流速的改变而改变,随样品体积的增加而上升,但柱床高度对hEGF的分配系数几乎无影响。hEGF的标准偏差随进样量的上?……