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外源性超氧化物歧化酶拮抗6-OHDA诱导大鼠中脑多巴胺能神经元凋亡的实验研究

徐强

  帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种与年龄相关的神经变性疾病,中老年人多见,主要是黑质纹状体区的多巴胺(DA)能神经元的进行性变性和死亡。其主要的发病机制是氧化应激,线粒体功能不全,内源性毒素,神经营养因子保护作用下降,最终引起多巴胺神经元的变性和死亡。由于多巴胺的氧化代谢产物H_2O_2和别的氧反应性物质(ROS)在帕金森病发病过程中所起的重要作用,氧化应激备受关注。6-OHDA诱导的偏侧帕金森病模型鼠是研究帕金森病的常用动物模型,明确注入6-OHDA脑区内的氧化应激状态与神经元凋亡的关系,以及抗氧化物酶的活性是应用抗氧化物酶基因转导治疗帕金森病实验研究的基础和前提。本实验用健康成年雄性SD大鼠144只,随机分九组,分别为正常组、对照组、损伤组、实验对照组和实验A、B、C、D、E组。损伤组是在大鼠右侧黑质区立体定向注射6-OHDA(10μg/6μl);对照组是采用相同方法,以同等量的生理盐水代替6-OHDA向同一靶点注射;实验组则是采用相同方法,在注入6-OHDA的前1小时、同时、后1小时、7小时和12小时注入外源性SOD蛋白90IU/6μl于大鼠右侧黑质区,分别为A、B、C、D、E组。实验对照组是生理盐水(6μl)与6-OHDA(10μg/6μl)同时注入大鼠右侧黑质区。术后10天用阿扑吗啡腹腔注射诱导大鼠的旋转行为。应用试剂盒检测动物双侧中脑组织的总抗氧化能力、活性氧、T-SOD和CuZn-SOD活性,以明确中脑内的氧化应激状况。应用抗TH免疫组化染色法和TUNEL法观察中脑黑质部位多巴胺能神经元和凋亡细胞,明确6-OHDA致多巴胺能神经元凋亡和外源性SOD的拮抗作用。实验结果:1.年为学改变:术后10天用0.5mg/kg阿扑吗啡腹腔注射检测各组大鼠的旋转行为。实验对照组、损伤大鼠旋转圈数最多,平均转速分别为187.9±19圈/30min,166.7±31圈/30min;实验各组旋转圈数有所减少,转速下降,旋转的周径增大,以实验B组圈数减少最为显著,C、A、D、E组依次递减。正常组、对照组无定向旋转行为。2.检测各组动物双侧中脑组织的总抗氧化能力变化:正常组左、右中脑组织的总抗氧化能力与其它各组均有显著差异(p<0.05),右侧以实验B组最为显著。其余各组间左、右中脑组织的总抗氧化能力和各组自身左、右侧中脑组织的总抗氧化能力均无明显差异。3.检测各组动物双侧中脑组织的活性氧变化:实验对照组活性氧升高最为明显,对照组、损伤组、实验对照组、实验D组和实验E组与正常组、实验 A组、实验 B组、实验 C组之间有显著性差异h的刃5人其中实验B组的活性氧下降最为明显。各组自身左、右侧中脑组织的活性氧以对照组、实验对照组、实验D组差别较为明显(P(.05),其中实验D组尤甚。4.检测各组动物双侧中脑组织的总 SOD和 Ct1ZnSOD活性表明,实验A、B、C组右侧中脑组织的总SOD与对照组相比下降最为明显(P<0.05),以实验B组尤甚。而实验D组、E组中脑组织的总SOD升高,并且,右侧较左侧高,其它各组均为左侧高于右侧。对照组、实验对照组、实验A、B、C组右侧中脑组织的CuZnSOD与正常组、实验D组、E组有显著性差异…”.05人自身左侧中脑组织的CuZnSOD较右侧高最为明显的是对照组、损伤组和实验对照组。右侧高于对侧较为明显的是实验D、E组。5.免疫组化检测表明损伤组、实验对照组右侧黑质区TH样免疫反应阳性细胞大部分消失,阳性细胞数较其它各组显著减少…州.05人减少到98.2土7.9%。而实验各组右侧黑质区TH样免疫反应阳性细胞减少程度下降,减少幅度从大到小依次是B组、C组、A组、D组、E组。对照组和正常组黑质区可见成簇的TH样兔疫反应阳性细胞。6.TUNEL法显示模型组大鼠中脑黑质致密部(SNC)有大量染色阳性细胞,呈棕黑色,不规则形,可见细胞裂解的凋亡小体。而处理组右侧黑质区染色阳性细胞数有所减少,减少幅度依次是I3组、C组、A组。D组、E组。对照组和正常组未见明显的染色阳性细胞。通过本实验,明确了60}JDA损毁的偏侧SD大鼠中脑区的总抗氧化能力、活性氧、SOD的活性变化情况、以及外源性SOD对氧化能力的影响和抬抗细胞凋亡作用,以及外源性SOD桔抗作用的时相性关系。研究发现6-OI们A注入黑质区后,抗氧化能力、活性氧和 SOD活性都有所升高,应用外源性SOD后提高了注药区的SOD活力。说明在6-0llDA致偏侧旋转大鼠多巴胺能神经元凋亡的过程中,氧化应激起着一定的作用,证实了神经毒素致多巴胺能神经元的损伤机理与帕金森病病人的发病机制之3间,有一致的氧化应激,而外源性SOD的介入,增强了对活性氧的灭活能力,一定程度地桔抗6-OHDA引起的氧化应激,削弱了个OHDA的神经毒作用,提高了多巴胺能神经元的存活率,改善了大鼠的旋转行为。本实验为进一步以氧化应激为突破点治疗帕金森病提……