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Nested PCR检测微量隐孢子虫卵囊的研究及其应用

严若峰

  从某奶牛场分离出隐孢子虫卵囊,用金胺酚-改良抗酸染色及饱和蔗糖漂浮后,通过显微镜检,根据其形态、结构、大小等特性鉴定为鼠隐孢子虫(Cryptosporidium muris)。根据隐孢子虫18s rDNA序列,借助计算机分析,设计并合成出隐孢子虫属特异性和鼠隐孢子虫种特异性引物。在经优化的反应条件和扩增参数下进行聚合酶链式反应,扩增出540bp的片段。初始PCR产物进一步作NestedPCR,扩增出一条250bp的片段。结果表明,该片段是鼠隐孢子虫所特有,以艾美耳球虫、伊氏锥虫、贾第虫、大肠杆菌等病原的DNA为模板进行扩增反应,均无此片段。Nested PCR具有高度敏感性,可以检测出1个纯化的隐孢子虫卵囊。当样品中卵囊密度高于10个/g(ml)时,该方法亦能很好的检测出。与常规PCR、饱和蔗糖溶液漂浮法及金胺酚改良抗酸染色法比较,Nested PCR的敏感性是常规PCR的10~3倍以上、是漂浮法和染色法的10~5倍以上。本文还比较了4种卵囊DNA提取方法,结果表明2%二硫苏糖醇冻融法具有很好的敏感性,而且其操作简便,快速易行。应用Nested PCR技术,对奶牛粪便、牛奶、污水等119个样品隐孢子虫感染及污染情况进行了检测,检出率分别为23.29%、11.11%和0.00%,均高于常规PCR、漂浮法和染色法的检测结果。综上所述,新建立的Nested PCR技术是一种具有较高特异性和敏感性的微量隐孢子虫卵囊检测方法,具有较好的应用前景。……   
[关键词]:鼠隐孢子虫;奶牛;微量检测;套式聚合酶链式反应
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2001年