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热休克蛋白70复合物抗人肝癌免疫的实验研究

王小平

  原发性肝癌是死亡率很高的恶性肿瘤之一,其起病隐匿,发现时往往到了中、晚期,失去了治疗的良好时机。既使早期诊断和手术治疗,仍存在较高的复发和转移率。所以采用手术、放疗、化疗以及生物治疗的综合疗法成为治疗原发性肝癌的首选方案。热休克蛋白(HSP)是一类广泛存在于生物有机体内的高度保守的蛋白质。在正常生理状况下,少数表达参与细胞内各种新生肽链的结合、装配、跨膜转运。应激状态时,通过某些机制诱导表达,发生快速短暂的明显升高。通过与细胞内变性的蛋白质结合,协助其复性或将其运送到溶酶体降解以维持细胞正常的生命代谢。无论是病毒转化或化学诱导的肿瘤细胞均可高表达HSP分子,应激时,HSP表达明显升高。HSP在肿瘤细胞的高表达是肿瘤细胞无限增殖和代谢的需要,也是肿瘤细胞发生发展过程中基因产物相互作用的结果,HSP可与一些癌蛋白相互作用,相辅相成,共同维持肿瘤细胞的增殖和恶性特征。实验表明,由于HSP所具有的“分子伴侣”作用,无论高表达HSP的肿瘤细胞或从肿瘤细胞中提取的HSP-多肽复合物;无论体外重组或偶联形成的HSP-多肽复合物均可在体内、体外诱导特异性的细胞免疫保护反应,产生移植瘤排斥反应。已证实小鼠和人来源的肝癌细胞存在一定水平的HSP70表达;从鼠源性肝癌细胞中提取的HSP70蛋白免疫小鼠,能够在体内诱发特异性的移植瘤排斥反应。而系统进行人肝癌细胞HSP70的表达规律及其抗人肝癌免疫的研究工作尚未见到。为研究HSP70在不同人肝癌细胞系及组织中的表达规律,以便为以后的提纯和免疫研究做基础,实验中首先用免疫组化、免疫荧光和流式细胞仪技术检测了不同人肝癌细胞系中HSP70的表达,结果发现,不同人肝癌细胞系在热处理前就有不同程度表达,应激后HSP70表达明显升高,在热处理后不同时间段呈现了HSP70从胞浆—胞核—胞浆的表达规律,研究发现HSP70在热应激处理后16h表达量达到最高。在此基础上,应用亲和层析和离子交换层析方法提取人肝癌细胞中SMMC-7721中热应激处理后16h的HSP70蛋白,SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,经紫外分光光度仪定量后,以HSP70提取物体外致敏人脾淋巴细第四军医大学博士学位论文胞,观察致敏后人脾淋巴细胞对人肝癌细胞系的细胞毒效应;同时设立抗体阻断实验,观察抗人HSP70抗体阻断肝癌细胞及抗人CD4、CDS抗体阻断致敏人脾淋巴细胞后,不同效靶比例下的细胞毒效应。结果发现,采用亲和层析和离子交换方法从人肝癌细胞系SMMC-7721中提取了HSP70蛋白复合物,并经 Western Blot证实;用 HSP70复合物作为免疫原体外致敏人脾淋巴细胞,在不同效靶比时对不同人肝癌细胞均呈现一定程度的杀伤效应;经抗人HSP70抗体阻断SMMC刁72后,结果致敏人脾淋巴细胞对其杀伤率明显降低;而致敏人脾淋巴细胞的杀伤效应经抗人CD4、CDS抗体阻断后也呈现一定的下降。为观察体内的免疫效应,获取2例肝癌标本,免疫组化证实存在HSP70表达后,分别采用免疫沉淀法和层析法提取HSP70复合物,定量后对病人进行了体内兔疫,观察免疫前、后自身外周血淋巴细胞对自身瘤细胞的杀伤率,结果在不同效靶比时,免疫后淋巴细胞较兔疫前呈现了较高的杀伤率。为深入了解HSP70的“分子伴侣”和免疫佐剂的效应,在体外重组AFP/HSP70真核表达载体,通过动物体内基因免疫,观察免疫后脾淋巴细胞对HePGZ细胞的杀伤效应,以获得对人肝癌具有普遍效应的共同疫苗。结果发现,构建真核载体能在转染的驼/0细胞中短时表达,基因免疫后能使小鼠脾细胞对HepGZ细胞呈现一定的杀伤效应。以上的实验结果提示:1.肝癌细胞系热应激前、后均有一定程度的HSP70表达,热应激后表达明显升高,并在一定时间段呈现了动态表达规律;2.体内、外细胞毒试验表明从人肝癌细胞和肝癌组织提取的HSP70复合物具有一定特异性,对自身肿瘤细胞呈现了较高而特异的杀伤效应:3.体外重建AFP/HSP70复合物,能在动物体内诱发针对表达AFP肿瘤细胞的一定的杀伤效应,为建立对肝癌普遍有效的疫茵奠定了基础。以上的研究结果提示对肝癌的免疫治疗可以在无须明确肿瘤抗原的基础上,通过体外重组或提取HSP70蛋白的方法进行体内免疫的方案来获得针对自身肿瘤细胞相对特异的细胞毒效应,上述研究为肝癌综合治疗方案提供了有益的探索,奠定了良好的基础。……   
[关键词]:肝癌;热休克蛋白70;免疫;细胞毒
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2001年