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人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

贾向志

  人溶菌酶(human lysozyme,hLY)参与机体的防御机制,有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用,具有潜在的临床应用价值,在食品工业上也具有广泛的用途。人溶菌酶属于溶菌酶中的C型。通常人溶菌酶是从人乳或胎盘中少量提取获得。由于来源困难,不能进行工业化生产,而采取DNA重组技术,从原核或真核表达系统生产人溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。常规的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统已广泛应用,虽已积累大量经验,但也存在不足之处,如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统,近年来已受到广泛重视,是一种非常具有潜力的真核表达系统。此系统不但能克服酿酒酵母表达系统的不足,而且具有高分泌、高稳定和高表达三大显著特点,分泌蛋白糖基化适中,外源蛋白的表达水平也比酿酒酵母高。本研究是以pUC19-hLY重组质粒DNA为模板,通过计算机辅助分MWpeffertwewdeteat析,设计合成两对引物J,PZ人 其5’端和3’端分别带有Xhd,ECORI酶切位点。通过多聚酶链式反应(PCR),扩增出人溶菌酶基因片断,并克隆至pGEM1载体中,经小量提取质粒,酶切鉴定筛选出阳性克隆。同时将其克隆至测序载体pBSKS“中。经小量质粒提取,酶切鉴定筛选出阳性克隆后用双脱氧链终止法进行核昔酸序列分析,结果与发表的人溶菌酶序列相比,在47斗8…之间缺失四个碱基*AT G。我们决定用P*R定点诱变,根据缺失的位置,设计并合成一对引物①3,P4),P3引物为6’-TGGCTACAGGGGAATCAGCC-3’),P4引 物 为(5’-TCCATTCCCAATCTTTTCAGTGTTC。3’),以缺失AATG 的质粒pUC 119上LY为模板,进行PCR扩增。将扩增产物切胶回收后进行自身连接,再转化到 Ecoli JM109中。对平板菌用 M13-47/RV-M进行 PCR检测。提取质粒DNA,用MI3,47引物测序,结果与文献发表的人溶菌酶序列完全一致。为了便于G4筛选高拷贝转化于,然后通过PPICg表达载体过渡到毕赤酵母表达载体pPICgK上,构建重组pPICgK七LY质粒。按照Invitrogen公司提供的方法,用Bglll酶将其线性化后,用电穿孔法转化至毕赤酵母mMDll68)感受态细胞。通过m.56)G418的压力筛选,能抗sing/mlG4的转化子被选出。为了进一步证实hLY基因与毕赤酵母菌侣MDll68)染色体基因组的整合,我们提取酵母菌总DNA,PCR法分析鉴定山LY稳定整合毕赤酵母菌SMDll68染色体基因组。我们选择能抗 4mg/ml和 sing/mlG418的重组子进行诱导表达。表达产物用SDS-PAGE测定,分于量约为15KD,与hLY分子量14.7KD接近;用薄层扫描分析,分泌蛋白占上清液总蛋白含量的46.7%(诱导72h和32.l%(诱导32h卜用免疫印迹将表达产物转移至硝酸纤维素膜上,用抗人溶菌酶抗体与之反应,加底物显色后,在人溶菌酶蛋白所在位置可显小一条特异性条带,说叨农达产物具有人溶凶酶的抗原性;川放色小球-3·窜四罩臣大像皿士快不菌琼脂平板溶圈法鉴定表达产物具有人溶菌酶的生物活性。以上实验证实表达产物为rhLY。以上研究工作将为下一步提取、纯化和对工程菌株稳定性监控,大规模发酵条件的摸索,打下一定基础。……   
[关键词]:人溶菌酶;巴斯德毕赤酵母;多聚酶链式反应;基因表达;压 力筛选;免疫印迹
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第四军医大学2001年