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白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段简并引物PCR、克隆及鉴定

吴明玮

  目的媒介昆虫的抗药性问题已经成为控制媒介昆虫、防治虫媒传染病的一个突出问题。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是生物神经传导中的一个关键性的酶,也是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶部位。媒介昆虫抗药性与乙酰胆碱酯酶结构基因点突变密切相关,但迄今为止尚未在蚊中发现与抗性有关的乙酰胆碱酯酶结构基因点突变位点,而且目前已知的蚊乙酰胆碱酯酶基因DNA序列只有斯氏按蚊一种。本实验选择与虫媒病密切相关的白纹伊蚊为研究对象,采用PCR及分子克隆技术,拟从白纹伊蚊基因组DNA中获得乙酰胆碱酯酶基因(acetylcholinesterase gene,Ace)片段克隆及其DNA序列,为进一步研究蚊乙酰胆碱酯酶与抗药性的关系打下良好的基础。——方洁1.蚊基因组DNA简并引物PCR扩增提取蚊基因组DNA为模板,借助于果蝇和斯氏按蚊AChE氨基酸 序列保守区域设计一对简并引物,利用简并引物对白纹伊蚊AChE基因片段进行扩增。2.白纹伊蚊Ace片段的克隆与鉴定PCR产物经与T一载体连接并转化至宿主菌JM—109,用碱裂解法提取重组的质粒DNA并对重组质粒进行酶切鉴定和 PCR鉴定。3.Ace片段克隆测序并分析重组质粒的阳性克隆进行DNA测序,利用互联网和 PCGENE软件与部分己知物种的AChE氨基酸序列进行同源性分析并构建进化系统树。结果1.获得与设计相符的白纹伊蚊AChE基因片段PCR扩增产物。2.获得并鉴定出白纹伊蚊AChE基因片段克隆。3.获得白纹伊蚊AChE基因片段的DNA序列,该片段含有一乙酚胆碱酯酶基因相当保守的特征性序列即围绕活性位点丝氨酸的6个氨基酸残基是FGESAG,该肽段在目前研究的所有脊椎劝物和无脊椎动物的胆碱酯酶中完全一致。4.通过对乙酚胆碱酯酶基因片段克隆的测序结果进行同源性分析发现,其氨基酸序列与埃及伊蚊相应片段的同源性最高,达96%;与斯氏按蚊同源性为87%;与黑腹果蝇为69%。2——结论从白纹伊蚊敏感株中获得了AChE基因片段克隆及其DNA序列,这在国内外尚数首次报道。……   
[关键词]:白纹伊蚊;乙酚胆碱酯酶;抗药性;简并引物PCR;克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2001年