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Bcl-2mRNA反义药物的设计和白血病细胞药物敏感性研究

雷小勇

  目的:探讨RNA二级结构预测程序RNAstructure3.5模拟bc1-2mRNA二级结构对bc1-2mRNA反义作用靶点选择的影响;观察不同靶点的反义寡核苷酸对白血病细胞株HL60、K562细胞生长活性、bc1-2mRNA和蛋白水平、细胞凋亡率和药物敏感性的影响;观察并比较不同结构骨架的反义物质—反义肽核酸与反义寡核苷酸对HL60、K562生物学作用的异同;观察不同靶点的反义药物对临床白血病人细胞生物学活性的影响。方法:用RNA二级结构预测程序RNAstructure3.5预测bc1-2mRNA的二级结构;用程序Blast对选定的序列进行人类基因组相似性评估证实序列在人类基因组中具有唯一性;用Quickfold程序评估选定的反义序列出现自我杂交或形成发夹的机率;Melting程序计算DNA/mRNA的理论熔点;用程序Lalign评估序列相互之间形成二聚体的机率;细胞记数观察细胞的生存情况;MTT法测药物的半数抑制率(IC50);用流式细胞仪、形态学观察及凝胶电泳观察细胞凋亡;免疫荧光标记和半定量逆转录PCR观察细胞bc1-2蛋白水平和mRNA水平。结果:在五个初选的反义序列中,靶向bc1-2mRNA蛋白编码区和翻译起始区的反义寡核苷酸能有效地抑制HL60、K562细胞的生长活性,并且靶向蛋白编码区的反义寡核苷酸1的作用比靶向翻译起始区2的强。与抑制细胞的生长活性表现一致,两个不同靶点的反义寡核苷酸能明显地下调bc1-2蛋白的表达,并且胞内的bc1-2mRNA水平也随之降低;在一定范围内,其作用是剂量和时间依赖性的;靶向bc1-2mRNA蛋白编码区的反义寡核苷酸1降低细胞bc1-2蛋白和学位论文:Bcl-ZmRNA反义药物的设计和白血病细胞药物敏感性研究中文摘要mRNA水平、促进细胞凋亡的作用较靶向翻译起始区的反义寡核昔酸2强。同时,随机的无义寡核昔酸对白血病细胞的生长活性、bclZ蛋白水平及mRNA水平无影响。靶向 bclZ mRNA蛋白编码区和翻译起始区的反义寡核昔酸能提高 HL60、K562细胞对VP16、Ara七、DNR和 AszO。的敏感性。HL60、K562细胞与反义寡核昔酸和化疗药物共同培养48小时,琼脂糖凝胶电泳观察到明显的DNA梯带,反义寡核昔酸1作用的处理组比反义寡核昔酸2作用的处理组小片段的DNA更亮更宽。与反义寡核昔酸二比较,反义寡核昔酸1提高HL60细胞对Ara(、DNR的敏感性及K562对Ara七的敏感性的作用要强些。从形态学上观察,可见细胞凋亡时出现的一系列形态学变化。流式细胞仪检测发现反义寡核昔酸诱导细胞凋亡的作用呈现剂量依赖性。靶向bclZ mRNA蛋白编码区的反义肽核酸能有效地抑制HL60、K562细胞的生长活性,降低hcf-2蛋白的水平和促进细胞凋亡,并且脂质体载体有助于反义药物在细胞内发挥其反义作用。在急性白血病和慢性淋巴细胞系白血病细胞中,bC12蛋白水平较高* 例AL细胞B。12蛋白阳性率均数为43 ZI%,3例CLL细胞BC12蛋白阳性率均数为68.33%卜两个不同靶点的反义药物能促进化疗药物诱导的细胞凋亡,降低bC12蛋白水平;并且,反义寡核苦酸1处理组比反义寡核昔酸二处理组作用要强。结论:*)分别在 bC12 mRNA翻译起始区和蛋白编码区发现了两个有效的反义作用靶点,针对这两个靶点的反义寡核昔酸能特异性抑制HL60和K562细胞的生长活性、降低bclZmRNA和蛋白水平、促进细胞的凋亡和改善细胞对Vp、Ara七、DNR和As。O。敏感性;o)靶向bclZ蛋白编码区的反义肽核酸有显著的反义作用,并且其作用持续时间比相同条件下的反义寡核昔酸长:*)靶向bC12mRNA翻译起始区和蛋白编码区的反义寡核昔酸能增强临床白血病人AL细胞对Vp、Ara-c、DNR的敏感性和CLL细胞对Arp*及DNR的敏感性;(4)在仇 12mRNA翻译起始区外存在着有效的反义作用靶点……   
[关键词]:BCl-2;药物设计;反义寡核苷酸;反义肽核酸;白血病;凋 亡;药物敏感性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:暨南大学2001年