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农杆菌介导几丁质酶基因转化大豆子叶节主要影响因素的研究

刘北东

  本研究以10个东北主栽大豆品种(系)的子叶节为受体材料,研究了大豆子叶节高效再生体系的建立,以及农杆菌介导法遗传转化的主要影响因素。建立了稳定的遗传转化体系,获得7株PCR检测呈阳性植株。初步证实菜豆几丁质酶基因已经整合到大豆基因组中。本研究主要结论如下:1.再生体系的建立a.在供试的10个大豆基因型中,3个高效再生基因型为合丰35、合丰25和黑农40,每个外植体分化出的丛生芽数量分别是:6.69、6.32和5.98。b.不同基因型子叶节丛生芽分化适宜培养基为:合丰35、合丰25:MSO+1.5mg/l BA+0.2mg/l IBA黑农40:MSO+1.2mg/l BA+0.2mg/l IBAc.适宜的外植体大小为保留3/3子叶。合丰35、合丰25和黑农40保留3/3子叶时每个外植体分化出的丛生芽数量显著高于保留1/3子叶。d.大豆丛生芽生根培养基确定为:MSO+2.0mg/l IBA;3个基因型的生根率分别是:合丰35为75.32%、合丰25为71.11%、黑农40为81.67%,显著高于对照。2.选择压的确定卡那霉素的筛选效果好于新霉素。浓度分别是:丛生芽分化阶段,合丰25为100mg/l,合丰35、黑农40为125mg/l;生根阶段,合丰25为10mg/l,合丰35、黑农40为15mg/l。3.除菌剂的确定除菌剂为头孢唑啉钠,适宜浓度为500mg/l。4.遗传转化体系的建立a.适宜的超声波处理时间范围为小于12s。在此范围内,对3个基因型每个子叶节分化丛生芽的数量及外植体的分化率均无显著影响;b.合丰35是遗传转化的理想的植物材料,每个子叶节产生抗性芽的数量为1.0,显著高于合丰25和黑农40。外植体的分化率为65.59%显著高于黑农40。c.菌株EHA105的转化能力高于菌株LBA4404。用EHA105进行遗传转化每个外植体得到的抗性芽数为0.86,外植体分化率为77.42%。显著高于菌株LBA4404。d.影响遗传转化的4个因素正交实验的较优组合是:预培养培养基蔗糖浓度6%、超声波处理时间12s、菌液浓度OD_(600)=0.5、共培养时间3天。影响程度依次为:共培养时间、蔗糖浓度、超声波处理时间、菌液浓度。5.转化体的PCR检测经PCR检测,获得7株阳性植株,合丰35为5株、合丰25为1株、黑农40为1株。通过对抗性苗和抗性芽分别进行PCR检测,结果表明经过两次筛选得到的抗性苗的阳性率为33%,高于只经一次筛选的抗性芽的阳性率。……   
[关键词]:大豆;子叶节;农杆菌介导;几丁质酶基因;再生;遗传转化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2001年