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人血小板因子4在家蚕细胞和幼虫体内的表达

于威

  人血小板因子4(Human Platelet Factor 4,简称hPF4)是一种发现于骨髓巨核细胞和血小板α-颗粒的蛋白质。PF4是一种典型的多功能蛋白,目前已发现PF4具有抗肿瘤、中和肝素抗凝作用、免疫调节活性、组织损伤修复、诱发炎症反应等多种生物学功能。近年来人们对PF4进行了广泛的研究,目前PF4已越来越受到基础医学和临床医学的重视。本研究首先将hPF4基因在大肠杆菌中进行了高效表达。通过PCR及酶切反应将PF4基因克隆到大肠杆菌热诱导表达载体pBV221中,获得了大肠杆菌表达载体pBV-PF4,并在JM109菌株中进行了热诱导表达,表达产物经Western杂交检测具有很强的兔疫活性,在约7.8kD处有一条明显的条带,与目的蛋白的分子量大小一致,表明PF4基因在大肠杆菌中得到了表达。ELISA检测结果也表明表达产物具有明显的免疫活性,表达量达到 9.968μg/ml菌液。此外,我们还首次将hPF4基因在家蚕杆状病毒表达载体系统中进行了表达。将克隆到的PF4基因通过适当的酶切后插入转移载体质粒pBacPAKS的多克隆位点中,获得重组转移载体pBacPAK-PF4,然后将pBacPAK-PF4与已酶切线性化的杆状病毒BacPAK6共转染家蚕培养细胞,二者在细胞内发生同源重组,通过空斑筛选得到了纯化的重组病毒rBacPAK-PF4。DNA点杂交和Southern杂交结果均证实了PF4基因已经插入到了杆状病毒基因组中。我们首先在家蚕培养细胞中表达了PF4基因,Northern杂交结果表明PF4基因在家蚕培养细胞中发生了转录,rBacPAK-PF4以10MOI的滴度感染2×106细胞,表达产物采用体外培养的血管内皮细胞ECV304对其生物学活性进行测定,测活结果表明家蚕培养细胞中表达第 3天的表达量达到了最高值,为 6.088μg/2×106个细胞,胞内表达产物对血管内皮细胞的生长抑制率达到90.6%。ELISA检测结果表明,表达产物能与兔抗人PF4一抗发生免疫反应,表达的PF4蛋白具有兔疫活性。Western杂交在约8kD和17kD处有两条特异性的条带,表明PF4在BmN细胞中的表达产物可能以两种形式存在,其中17to的蛋白可能是在产物后加工过程中糖基化等修饰比较完全所致,8kD蛋白可能是糖基化程度较低所致。二互#rBacPAKPF4在家蚕培养细胞中的表达量与接种病毒的MOI也具有一定的相关性,表达量随MOI的增加呈对数增长趋势。同时我们也在家蚕幼虫和蛹中对hPF4进行了表达,二者的表达结果相似,都是在感染第 5天的活性最高,其中在蚕血淋巴中的表达量约为29刀2 u g/ml,对内皮细胞生长的抑制率可达到92.3%。蚕血淋巴的Western杂交结果与在家蚕培养细胞中表达产物的杂交结果极为相似,都是在约skD和17kD处有两条特异性的条带,表明PF4在蚕血淋巴中可能也是以加工后的成熟蛋白和未加工的蛋白两种形式存在。同时也采用了ELISA检测法对蚕体的表达产物进行检测,测定结果也与细胞检测结果相似。我们还对hPF4蛋白在家蚕培养细胞、蚕体和大肠杆菌内的表达情况进行了比较,结果表明:蚕血淋巴的表达量要高于大肠杆菌的表达量,约为其2.9倍;一条蚕的表达量约等于6瓶家蚕培养细胞的表达量。家蚕表达载体系统与现有的几种较成熟的真核表达系统相比,其突出的特点就是表达的高效性。PF4在临床上应用的有效剂量较高臼0 p g/Kg入 运用家蚕表达系统表达PF4蛋白可获得大量有生物活性的PF4蛋白,恰好可以满足在临床上的大剂量应用,且可以大幅度降低成本,为今后在临床上肿瘤化疗中的广泛应用打下基础。……   
[关键词]:人血小板因子4(hPF4);大肠杆菌表达系统;家蚕杆状病毒表达系统;表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2001年