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禽传染性支气管炎病毒新的变异株核衣壳基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

丁红梅

  本研究用Tizol试剂直接从尿囊液中抽提病毒核酸,参考已报道的IBV-Beaudette核衣壳基因,自行设计—对引物,以IBV—N毒株(肾型)、ZJ971毒株(腺胃型)和一个参考疫苗毒株H52为模板,用RT-PCR扩增它们的核衣壳基因,将扩增得到的cDNA克隆入pBluescript SK载体中。用LasefgeneanalysiS软件分析它们的核苷酸和推导的氨基酸序列。在此基础上,把ZJ971毒株核衣壳基因克隆到pBV220表达载体,利用大肠杆菌进行原核表达,并用Western-blotting检测。结果显示:ZJ971毒株、N毒株、H52毒株的核衣壳基因ORF全长都为1230个核苷酸,均编码一条409个氨基酸组成的多肽。腺胃病变型IBV-ZJ971毒株与其他各血清型IBV的核昔酸同源性在87.0%—98.6%之间,氨基酸同源性在91.0%一98.1%之间。171位氨基酸突变导致这一区域的亲水性大为增强,但283位氨基酸突变导致邻近的282位亲水性下降,使其最大疏水峰由197位移到282位。系统进化分析表明 ZJ971毒株与DI 466、Cu/TZ毒株的亲缘关系较近,它们可能有共同的祖先。肾病变型IBV-N毒株与其他各血清型IBV的核苷酸同源性均不高(86.6%—87.4%),氨基酸同源性在90.5-91.7%之间。其中189-190、223、236、286、334-336位氨基酸的突变使上述5个区域的亲水性明显下降,240、301位氨基酸的突变使这两个区域的亲水性稍有上升,整个蛋白的平均亲水值比其它IBV小。系统进化分析表明N毒株与其它毒株(包括肾病变型Gray)的亲缘关系均较远,处于相对独立的一支。综合上述结果进一步从核衣壳蛋白基因角度证实 ZJ971 毒株、N毒株是不同于其它各型IBV的新的变异株。Western-blotting 只在重组表达菌样品中检测出一条约45kD的特异性蛋白条带,与预期的蛋白分子量大小一致,表明 IBV-ZJ97毒株的核衣壳蛋白确实在大肠杆菌中获得了高效表达,表达的核衣壳蛋白具有一定的金免疫反应性,为进一步研究和开发IBV基因工程苗奠定基础。……   
[关键词]:鸡传染性支气管炎病毒;核衣壳基因;克隆;表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2001年