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外源基因在家蚕中的插入与表达研究

陈秀

  转基因动物研究是目前生物科学的研究热点之一。家蚕是重要的经济昆虫,更是经典遗传学研究的模式生物之一。进行转基因蚕研究具有重要的理论意义和实用价值。它不仅为家蚕基因的结构、功能及表达调控的机制研究提供了帮助,也为家蚕的抗病育种研究及家蚕新品种的育成等提供了新途径,同时也为以家蚕为“生物反应器”的研究探索了新途径。自1996年起,对转基因蚕研究中报告基因的选择、目的基因的利用、导入方法、整合与表达策略及其检测,以及在转基因蚕个体筛选和转基因蚕系统维持等方面进行了研究。本论文主要报告如下三个方面的结果,并在最后一章对转基因蚕技术进行了小结和讨论。(1)新霉素抗性转基因蚕以新霉素抗性基因(Neomycin resistance gene,Neo~R)为选择标记,成功地筛选出阳性个体。首先构建了外源导入质粒pFN。其中含家蚕丝素重链基因片段,及蚕体内能高效启动的启动子IE和它驱动的抗新霉素基因。质粒经HindⅢ酶切线性化后,分别转染家蚕Bm-N细胞和导入家蚕早期受精卵中(产下后0~2小时)。在细胞水平,检测具有G418抗性的Bm-N细胞株基因组DNA显示:构建的线性外源质粒可插入细胞染色体,并能表达。在成体水平,经过把基因枪处理的蚕卵刚孵化的蚁蚕及以后各代,分别以含致死浓度新霉素的人工饲料饲育筛选48小时的方法,获得新霉素抗性转基因蚕。因通过这种饲育筛选方法,获得的个体数很可能就是转基因个体,所以减少了转基因后代的饲养规模和检测规模。G_2代和G_4代转基因蚕基因组DNA的PCR扩增、Southern杂交检测结果表明:①Neo~R基因已整合在家蚕染色体上;②获得了新霉素抗性转基因蚕;③新霉素抗性基因可作为转基因蚕研究中有效的选择标记。.︾.-︾Q)抗NPV核酶转基因蚕核酶(Ribozyme)是一种具有牛物催化活性的小RNA分于,具有专一切害峋巴 mMA的特性。家蚕核多角体病毒(Bom…morlNuclearPolyhedrosls%ms,BmNPV)病是生产实践中危害较为严晕的翻麻,本研究尝试将针对 N’I,V的核酶基因导入家蚕基因组,期望获得核酶转基因家蚕,利川其具有抑制病毒的复制、增殖的功能,减轻感染发病率,为养蚕牛)“卜控制核多角体病毒病的研究提供依据。钉先,设计片。合成厂二联锤头状核酶p8 NRzNRz426,分别针对在家贞核多角体病稀复制中起霍要作川的匝 Jk山一mmediately early stage gene,IE)mNNA的二个4讣仆立/、\;,X次,构建川厂家妖细胞水个和成体水个研究的联合,巨组质粒 pIE-Luc-Rz*该)员粒禽家众核多AI体仙fly/ IE}/j。力J’、荧光东酶(Luciferase)}(**人不旧卜N卜VI巳核酶从山pBN*z*b;巾到顺*pl巳卜nC-仇转染家证纠1胞株8*-N ill,给该自1胞株接利。smNPV的纠人大川,瓜核灿V介家企细胞水个能介效抑制日inN*V**A V制;;进小试将i亥联介质粒导入企人纣纠t:pIE-LllC-RZ f郴L4制例Z内L)]酶 At’ti线上t化)ti,)!U占卜枪法日入家灰\’拟]受粘匀(G。),卜G;{ 企的n龄第-大上h收邮分血淋巳进竹炎光素酶活性测走,筛选出阳性个体后,继续饲养:以后分别厂GZ、民、q、q代的二龄起蚕用N’I, V进行接种筛选,选出半致死浓度明显高厂对照区的蚕进行传代。其中民代获得一区对NP V抗性比对照组高约10倍的转基因蚕。对该区五龄蚕基因组DNA的 PCR检测和 Southern杂交显示,约有90%含有目的外源DNA片段,核酶基因及荧光素酶DNA均多拷贝地整合在家蚕染色体上。利用RT-PCR检测到蛹期核酶的表达,并巳表达产物具有体外切割活性。这也表明,荧光素酶基因是转基因蚕研究有效的报告基因之一。讨沦了核酶在家蚕抗病毒育种和转基因蚕方面的应用前景。综合本章结果:核酶基因导入蚕体有效地抑制了 N’I,V DNA的复制、增殖;获得了一定程度上抗V的转基因蚕品种AF 2:也为利用核酶抑制病毒﹃!!.︾-病的“基因治疗”研究提供了参考。(3)利用同源重组将 GFP导入家蚕、整合至nb-L链鳞翅目昆虫及其细胞株,是利用杆状病毒表达系统表达同源重组蛋白的理想宿主之一。Yamaoetal.门)年报告了利用杆状病毒AcN’PV实现向家蚕染色体的基因(Gene Tarseting)打靶实验。我们在研究了转基因蚕的导入方法以及证实GFP可在家蚕系统表达之后,进一步尝试厂利用同源重组策略将GFP弓入家蚕染色体组。实验以蚕丝心蛋〔]轻链基区(ibroinlightchaingene,Fib-L)外显子 2和 3为靶基冈,利用电穿孔方法导入外源基冈,同源氧gll GFP基因至FibL的内含f 2。营先采川 PCR的方法,扩“增出 F山-L的外拈 Je 2和外显-了3;;冉将它们同*FP基因拼接在一起,构建成同源重组融合表达质粒pZGFP3。川电穿孔法将线性外源DNA 9入家蚕早期受精卵中。氏波长紫外灯照射后代茧,观察到有“亮(荧光)茧”出现;;纤P*R检测q代转征冈蚕基……   
[关键词]:转基因家蚕;新霉素抗性基因;核酶;基因治疗;同源重组
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2000年