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樱桃(Prunus mahaleb L.)PGIP基因及其启动子克隆

张军科

  由于PGIP能构特异性地抑制病原菌PG酶活性,因此PGIP基因在果实病理性软化过程中起重要作用,克隆PGIP基因可用于果实采后基因工程。果树PGIP基因的表达受乙烯、伤害、水杨酸和病原菌侵染诱导,此基因启动子为诱导性启动子,并具有器官特异性,因此获得PGIP基因启动子,对其克隆和测序,对研究该基因在果实成熟和软化期间表达的调控模式有重要应用价值和理论意义。本试验以樱桃砧木马哈利樱桃(Prunus mahaleb L.)为材料,根据Genbank中已发表的PGIP基因序列,经同源性分析,利用其中的保守序列设计了一对引物,首先通过RT-PCR获得了一个大约为1000bp的目的片段,经克隆测序,证实该片段全长1045bp,包含一个完整的开放阅读框架,该阅读框架由990碱基组成,编码330个氨基酸。PGIP cDNA序列与杏、梨、苹果的PGIPcDNA序列同源性分别达97.2%、83.4%、83.6%,PGIP基因cDNA可能编码的氨基酸杏、梨、苹果的PGIP cDNA所编码的氨基酸的同源性分别达到96.7%、85.2%、85.2%,说明该片段确实为PGIP cDNA序列。该序列已在Genbank登录,登录号为AF263465。在获得PGIP cDNA序列的基础上,本研究进一步对PGIP基因DNA序列进行了克隆,确定内含子的位置和大小。通过对基因组DNA的PCR扩增获得了一个大约1200bp的目的片段,并对该片段进行了克隆和测序。测序结果表明,该片段全长1192bp,经同源性分析,该片段与杏、梨、苹果等植物的cDNA序列同源性分别达到94.1%、82.4%和75.2%,并表明该片段可能含有内含子。PGIP基因DNA序列和cDNA序列对比分析结果表明,在转录过程中,除去除内含子外,未发生其它修饰;PGIP基因DNA序列中包含两个外显子和一个内含子,两个外显子长度分别为由581、464bp,内含子较小,全长147bp,位置在DNA序列中段。本研究设计了一种染色体步移方法接头式嵌套PCR法用于启动子序列的克隆,并设计了反向PCR、锚定PCR和接头式嵌套PCR引物,采用了反向PCR、锚定PCR和接头式嵌套PCR等染色体步移方法进行了PGIP基因上西北农林科技大学博士论文游包含启动子的序列的克隆。实验结果表明,在三种方法中,接头式嵌套PCR法较易获得成功。反向PCR由于步骤繁杂,很难获得大量的环状模板,扩增较难获得成功,锚定PCR法由于筛选随机引物工作量过大,且不易获得正确克隆,也很难获得目的片段。本研究用接头式嵌套PCR法成功的获得了大约 2200hp的片段,该片段包含 PGIP基因部分序列及其上游序列。经克隆测序,该片段序全长 2268碱基。经初步分析,在该片段的 19631、距基因起始密码子 148hp处有一个 IAIA盒,在该片段的 1886q、距起始密码子 225hp处有一个 CAAT盒,在 19lllgl6bp、CAAT盒和 IAIA盒中间有一个G盒序列,在1251-1279、1295-1323包含一个29碱基的直接重复序列,具备植物启动子的基本特征。为了验证本研究中所获得的片段是否具有的启动活性,以此片段替换PBllZI上的CaMV 355启动子,构建了此片段启动下的报告基因GUS的表达载体,通过三亲杂交将其导入农杆菌。为了对烟草和樱桃进行转化,进行了樱桃叶盘再生体系研究。樱桃叶盘在 MS附加 IBA3刀 m叭的培养基上可有效生根。植腑腕记Kan的适皱择浓度为30m叭。Cef的浓度为100一200mg/L脱除农杆菌时对叶盘生根影响较小。用农杆菌介导法侵染烟草和樱桃无菌苗叶盘,叶盘经离体诱导分化后,对所获得的樱桃抗性根和烟草抗性根及植株叶片用组织化学染色进行了GUS表达检测。检测结果表明,此片段诱导了GUS基因烟草叶片和根中的表达,在樱桃的抗性根中也能构表达。说明此片段包含启动子序列。进一步确定启动子元件的工作正在进行中。……   
[关键词]:樱桃;多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因;启动子;克隆;转化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2000年