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表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究

贾永清

  本研究利用RT-PCR方法扩增到一条1.7kb的A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)(GD3)DNA片段,经酶切分析后平端克隆到pUC18中进行了序列测定和分析。结果表明所扩增到的HA基因cDNA全长1731,包含了HA基因完整的开放阅读框架,共编码568个氨基酸,其中信号肽16个氨基酸,HA1 330个氨基酸,HA2 222个氨基酸,并含有起始密码子和终止密码子。GD3与GD1、HK156和HK258核苷酸同源率分别为99.4%、98.6%和98.3%,其受体结合位点和裂解位点的核苷酸与氨基酸组成完全一致。酶切位点的氨基酸序列为一P-Q-R-E-R-R-R-K-K-R-G-L-P-,共有连续5个碱性氨基酸插入。本试验以LacZ作为报告基因构建了AIV HA基因禽痘病毒转移载体。经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传形状稳定的AIV HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的CEF细胞的DNA进行PCR,扩增出1.7kb的HA基因片段,证明所获得的重组病毒携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞培养物无上清液的细胞,用H5亚型AIV多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的兔抗鸡IgG为二抗进行Dot-ELISA检测,结果表明重组病毒能在体外的CEF细胞培养中表达HA糖蛋白。Western-blot检测结果证实HA基因表达产物为44kDa(HA1)和23kDa(HA2)的两条带,这两条带都具有与多克隆抗体结合的能力;未发现没有裂解的HAO的存在。用该重组病毒鸡翅刺种免疫60日龄SPF鸡,免疫3周后,每只鸡用50×LD_50的GD1株HPAIV攻毒,免疫组无一发病和死亡,攻毒保护率100%。而对照组鸡只全部发病并在攻毒后3~9天相继死亡,发病率和死亡率均为100%。HI抗体效价检测结果表明重组病毒免疫组鸡在免疫后7天即可检测到高效价的HI抗体,抗体效价在免疫后14天达到高峰,随后在较高水平上缓慢下降,攻毒试验对抗体效价及其变化没有影响。灭活苗免疫组鸡在免疫后14天方可检测到HI抗体,抗体效价于免疫后第五周达到高峰。对照组鸡免疫和攻毒前后无HI抗体检出。三组免疫组鸡不同组织器官病毒分离结果全为阴性,而所有对照组鸡都分离到病毒,且肺脏病毒分离率最高(83.9%),脾脏最低(12.9%)。T淋巴细胞亚类检测结果表明:重组病毒免疫后激发了机体的细胞免疫应答,使免疫活性T淋巴细胞活化,攻毒后,免疫鸡CD4~+、CD8~+T细胞和TCR1~+T细胞的数量增高或不变,而对照组鸡CD4~+、CD8~+T细胞和TCR1~+T细胞的数量急剧下降。总之,通过本试验研究,已经成功地获得了遗传性状稳定,目的基因表达效率高的AIV HA基因重组禽痘病毒,SPF鸡免疫和攻毒试验结果表明,该重组病毒疫苗能全面诱导机体的细胞免疫和体液免疫反应,对强毒攻击产生坚强的免疫保护。本论文基本完成了该基因工程新型疫苗的实验室研究工作,为进一步开展疫苗中试和投入现地使用奠定科学的理论和实验基础,也为我国高致病力禽流感的防制提供了物质储备。……   
[关键词]:禽流感病毒;HA基因;重组禽痘病毒;RT-PCR;HI抗体;T淋巴细胞
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:东北农业大学2000年