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红树林沉积物中琼胶降解菌原位富集及琼胶酶基因的挖掘、表达与性质分析

狄文婕

  琼胶寡糖由琼胶降解所得,在食品、药品、化妆品等领域有重要的应用价值。酶解法制备琼胶寡糖具有高效、底物重复性高和环境友好等优势,因而获得酶学性质良好的琼胶酶在琼胶寡糖生产中具有重要意义。本文针对此开展研究,主要研究内容和结果如下:(1)通过龙须菜原位富集红树林沉积物中琼胶降解菌,经16S r RNA基因多样性验证,富集后的结果是样品组Mgv-B富集效果最明显,表明在沉积物中富集得到了高丰度的多糖相关的降解菌。随后,通过高通量测序获得了大量来源于红树林沉积物中未培养微生物的琼胶酶基因资源,对其中30个具有完整开放阅读框琼胶酶基因在大肠杆菌中进行原核表达并验证其粗酶活性,其中21个具有琼胶酶活性。(2)在所获得的具有活性的琼胶酶基因中挑选出一条氨基酸序列比对相似性最低的基因,命名为aga M1。对aga M1基因进行原核表达与纯化,重组Aga M1(r Aga M1)分子量约为70 k Da,最适温度为50°C,最适p H为7.0。r Aga M1具有良好的温度及p H稳定性,在50°C下保温60 h后仍剩余36.53%的相对酶活,在p H 5.0及p H 10.0缓冲液中分别保温60 h后仍分别剩余62.15%和55.97%的相对酶活。Ag+、Cu2+、十二烷基硫酸钠(SDS)、Beta-巯基乙醇(Beta-Me)对酶活有明显的抑制作用;而盐酸胍(guanidine-HCl)、二硫苏糖醇(DTT)对酶活有明显的促进作用。r Aga M1的Km值为1.82 mg/ml,Vm值为357.14 U/mg,与底物亲和力较大。其降解琼脂糖终产物为新琼四糖和新琼六糖。(3)通过基因截短的方法初步探究基因缺失对琼胶酶活性的影响。结果表明,N端截短完全破坏了琼胶酶的活性。而C端截短的两个蛋白r Aga M1-01(从C端截短480bp)和r Aga M1-02(从C端截短960bp)则保留了对琼脂糖的降解活性,但酶活性均降低,且热稳定性、p H稳定性、金属离子和螯合剂的耐受性也均不如原始琼胶酶r Aga M1。进一步的分析发现,二者的最适温度没有发生改变,均为50°C,但最适p H均发生了改变,其中r Aga M1-01和r Aga M1-02分别为9.0和6.0。表明C端的480-960bp之间的序列对酶活作用p H具有重要影响。此外,r Aga M1-01降解琼脂糖终产物为新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖、新琼十糖及新琼十二糖,r Aga M1-02降解琼脂糖终产物为新琼八糖、新琼十糖及新琼十二糖。这些结果初步证明截短区域(C0-C960)对琼胶酶的活性、稳定性、离子耐受性及底物亲和力可能存在重要影响。此外,r Aga M1-01及r Aga M1-02可产生新琼八糖、新琼十糖及新琼十二糖高聚合度的新琼寡糖,而目前通过酶解法很难获得高聚合度的新琼寡糖,因而r Aga M1-01及r Aga M1-02和其产生的高聚合度寡糖在工业应用中具有重要的应用价值。……   
[关键词]:原位富集;琼胶酶;琼胶寡糖
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:国家海洋局第三海洋研究所2018年