手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

克氏梭菌己酸合成途径基因的鉴定及该菌遗传操作工具的构建

杨娇

  克氏梭菌是重要的己酸合成菌,己酸合成效率在众多己酸合成微生物中名列前茅。但长期以来,克氏梭菌的己酸合成途径关键酶编码基因并未得到鉴定,同时缺乏克氏梭菌的遗传操作系统,难以对克氏梭菌展开代谢工程改造研究。本课题将解析克氏梭菌己酸合成途径的关键酶编码基因,对于克氏梭菌产己酸关键基因中硫解酶编码基因功能进行解析。通过构建克氏梭菌遗传操作工具,实现对克氏梭菌的己酸合成途径代谢工程的改造。具体内容包括:(1)克氏梭菌发酵动力学显示,当以乙醇和乙酸为底物,克氏梭菌的主要代谢产物为己酸,仅合成少量的丁酸和微量的辛酸;当以乙醇和丁酸根作为碳源时,克氏梭菌产生己酸和微量的辛酸,丁酸呈现出净消耗。克氏梭菌脂肪酸合成酶系同时具有催化丁酸合成和己酸合成的能力,而酶的体内催化功能受初始碳源种类的调控。克氏梭菌产己酸关键基因的转录分析表明,在己酸合成过程中,各个酶编码基因呈现不同的转录水平和时序性。硫解酶编码基因(thlA1)和3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因(hbd1)转录水平最高。(2)克氏梭菌具有三个硫解酶编码基因(thlA1,CKL_3696;thlA2,CKL_3697;thlA3,CKL_3698)。通过转录组测序结合反转录-荧光定量RCR对三个硫解酶编码基因的表达水平和时序表达特征进行了分析。在菌体生长稳定期之前,thlA1基因维持恒定表达,thlA2基因表达时序上调,thlA3基因表达时序下调。当菌体生长进入衰亡期,三个硫解酶编码基因转录水平迅速下调。可见,三个硫解酶编码基因的表达严格依赖于菌体生长。硫解酶对(碳四)乙酰乙酰辅酶A的酶动力学测定结果表明,克氏梭菌三个硫解酶对于四碳底物均显示出相似的底物亲和力(K_m),ThlA1对四碳底物的催化效率(k_(cat)/K_m)低于ThlA2和ThlA3。(3)本研究针对克氏梭菌典型菌株DSM555,通过抗性筛选、电转条件优化、复制子选择、启动子选择等成功构建了克氏梭菌遗传操作工具(基因过表达系统),实现了将外源基因在克氏梭菌体内的表达。在克氏梭菌体内过表达了丙酮丁醇梭菌来源的醇醛脱氢酶编码基因(adhE2),adhE2过表达菌株产丁醇25 mg·L~(-1),己醇155 mg·L~(-1)。过表达菌株的丁醇和己醇浓度分别比野生型菌株高2.5倍和8.2倍。基于以上结果本研究得出,克氏梭菌具有三个有催化活性的硫解酶,在克氏梭菌体内均呈活跃表达。本论文成功构建出了克氏梭菌基因过表达系统,将促进对克氏梭菌的己酸合成机理研究及其代谢工程改造。……   
[关键词]:克氏梭菌;己酸;硫解酶;转录组;遗传操作
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2018年