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水产品中恩诺沙星残留胶体金免疫层析检测技术的建立及应用

余法建

  水产品中兽药残留问题日益突出,兽药虽在养殖过程中带来不少作用,但摄入人体后对人体危害大,严格把控水产品中的兽药残留就显得尤为重要。恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)是第三代喹诺酮类药物,由于其在组织液中浓度达到最高值速度快、组织分布范围广、抑菌的数量和种类多等诸多优点,且其代谢产物均有良好的抗菌作用,所以广泛应用于水产养殖中的疾病防治。由于部分养殖户存在不规范用药,容易导致恩诺沙星随着食物链进入人体,造成软骨组织、中枢神经、消化系统等方面的损伤,同时较大剂量还会造成神经系统的迟缓、肝脏损伤及皮肤过敏等个方面的问题。 本文通过采用胶体金免疫检测法,研究适用于现场快速监测水产品中ENR残留的检测体系。胶体金免疫层析法具有检测速度快、检测结果准确等优点,非常适用于这类现场快速检测。本次研究主要获得以下结果: 1.ENR-OVA人工抗原的合成。采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将ENR偶联到OVA上,经FPLC、紫外、SDS-PAGE电泳等的检测分析,ENR与OVA偶联成功,可以用于进一步试验; 2.多克隆抗体的制备。利用人工合成的抗原ENR-OVA免疫新西兰大白兔,抗血清经饱和硫酸铵法纯化后,用ELISA间接竞争法测得效价在1:8000~1:64000。其中以1号兔子的抗血清效果较佳,在此基础上建立的ELISA间接竞争法,检测ENR浓度在0.1~8.1ng/mL之间,以结合率B/B0值为纵坐标,标准品浓度为横坐标作曲线,通过拟合曲线获得方程:y=-40.613lg(x)+58.963,R2=0.9959,IC50为1.662。 3.胶体金制备。采用Frens法制备出20nm左右的胶体金颗粒,用K2CO3调pH到8.2,然后逐滴加入2mL0.1mg/mL的ENR-PcAb溶液,用BSA封闭,采用高速离心法纯化,最终获得深红色胶体金溶液。 4.试纸条制备工艺确定。胶体金标记恩诺沙星多克隆抗体喷膜量为65μL/cm2;Millipore的M180NC膜;检测线和质控线(划膜量均为1.0μL/cm);ENR-OVA和羊抗兔IgG包被浓度均为1000mg/L;样品垫前处理,用含1%PVP的0.01mol/L PBS(pH7.5)。采用此工艺制备出的试纸条最低检测限可低至0.9ng/mL,在虾和鱼组织中肉眼最低检测限分别为5ng/g、10ng/g。与ELISA间接竞争法比对中,试纸条对虾、鱼中ENR浓度分别大于5ng/mL、10ng/mL的样本,均能有效检出阳性,而低于该值时显色为阴性。试纸条在常温干燥条件下至少可保存一年。……   
[关键词]:恩诺沙星;胶体金免疫层析;兽药残留;水产品
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江海洋学院2014年