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丁草胺对斑马鱼的内分泌干扰效应研究

常菊花

  丁草胺属于酰胺类除草剂,它通过抑制杂草体内蛋白质合成而起到除草作用。斑马鱼具有产卵量多、前期胚胎透明、繁殖快、易于饲养等优点,成为继小鼠、果蝇、线虫之后又一新型模式生物。本论文采用鱼类活体(In vivo)实验方法,以丁草胺原药(我国应用最多的三个除草剂之一)为供试药剂,从下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-性腺轴和氧化损伤等角度,研究丁草胺对斑马鱼内分泌干扰效应,并探讨其可能的作用机制。 丁草胺对斑马鱼成鱼的急性毒性结果显示:丁草胺对斑马鱼成鱼96h的LC50值是0.49mg/L,根据农业部《农药安全评价准则》农药对鱼类毒性等级的划定标准,表明丁草胺对斑马鱼成鱼的毒性为高毒。采用GC—MS\MS对丁草胺原药中的杂质进行了鉴定,结果表明,96%丁草胺原药中主要杂质是二丁氧基甲烷和(2-氯-N-(2,6-二乙基苯基)乙酰胺。我们测定了斑马鱼整个生命周期中的甲状腺激素变化动态,结果表明斑马鱼的胚胎在28±1℃条件下,受精后48~72h内孵化,授精后0-3天胚胎孵化前T4和T3的含量没有显著变化;幼鱼体内T3含量在授精后第10天达到最高峰;幼鱼体内T4含量在授精后第21天达到最高峰。在斑马鱼生长后期,甲状腺激素会出现一个低平台期,本研究为将来选用斑马鱼进行污染物的内分泌干扰研究奠定了基础。 从下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT)调控角度出发,研究了丁草胺对斑马鱼幼鱼和成鱼体长、体重和生长因子等形态学指标的影响;运用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测丁草胺对斑马鱼成鱼血浆和幼鱼组织中甲状腺激素水平的影响;采用实时荧光定量PCR技术检测丁草胺对斑马鱼幼鱼甲状腺轴相关基因表达的影响。结果表明(1)丁草胺染毒30天后,25μg/L和100μg/L剂量可以导致斑马鱼幼鱼的生长因子(CF)增加,但是不同浓度丁草胺处理组中成鱼的生长因子与溶剂对照组相比,差异不显著;(2)丁草胺可以提高斑马鱼成鱼血浆中和幼鱼组织中甲状腺激素四碘甲状腺原氨酸(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)水平;(3)丁草胺可以使斑马鱼幼鱼促甲状腺激素释放激素(CRH)、促甲状腺激素(TSH)、转运蛋白(TTR)、甲状腺激素受体(TRα)、脱碘酶(Deio1)和纳/碘同向转运体(Slc5a5)等基因的表达量上调,葡萄糖醛酸转移酶基因(UGT1ab)基因的表达量下调,甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、脱碘酶(Deio2)和甲状腺激素受体(TRβ)的表达量没有变化。结果显示丁草胺对斑马鱼成鱼和幼鱼都具有一定的甲状腺干扰作用。 从下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)调控角度出发,研究丁草胺对斑马鱼成鱼产卵及后代的影响;运用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测丁草胺对斑马鱼成鱼血浆中性激素睾酮、雌二醇和卵黄蛋白原水平;采用实时荧光定量PCR技术检测丁草胺对斑马鱼幼鱼性腺轴的相关基因表达的影响,包括雌激素受体(ERα、ERβ1和ERβ2)、卵黄蛋白原(VTGI和VTG II)和芳香化酶(CYP19)等基因。结果显示丁草胺对斑马鱼的性腺轴具有一定的干扰作用,主要表现在(1)丁草胺可以降低斑马鱼雌鱼的产卵次数和产卵量;(2)丁草胺可以降低雄鱼的性腺指数(GSI),但是对成鱼的肝腺指数(LSI)没有影响;(3)丁草胺可以降低斑马鱼雌鱼血浆中的睾酮(T)和雌二醇(E2)水平,提高成鱼血浆中卵黄蛋白原(VTG)水平;(4)丁草胺可以使斑马鱼幼鱼卵黄蛋白原VTG II表达量上调,但是对幼鱼雌激素受体(ERα、ERβ1和ERβ2)和芳香化酶CYP19a的表达量没有影响。 以雌性成鱼为受试对象,研究丁草胺对斑马鱼肝脏抗氧化防御系统的影响。肝脏是主要的生物富集器官,故被大量地用于外源物质毒理研究。结果显示丁草胺对斑马鱼具有氧化损伤作用。主要表现在丁草胺可以降低斑马鱼雌鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽转移酶(GST)的酶活性以及谷胱甘肽(GSH)含量,对肝脏过氧化氢酶(CAT)活性没有影响。……   
[关键词]:丁草胺;斑马鱼;毒性;内分泌;甲状腺轴;性腺轴;氧化损伤
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2012年