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多基因转化构建重组工业酿酒酵母及其在木薯酒精发酵中的应用研究

阳辛凤

  在化石能源日益枯竭和纤维素、木质素燃料酒精生产技术尚不完善的背景下,我国已将热带能源植物木薯(Manihot esulenta Crantz)列为燃料酒精生产的重要原料。木薯酒精应用受限因素主要是生产成本高。酵母是酒精工业的“灵魂”,在酵母细胞中构建淀粉代谢途径和纤维素代谢途径,部分替代木薯酒精生产过程外源酶制剂的功能,就可节省酶制剂,同时提高淀粉转化率和酒精产率,降低成本。 本研究以工业酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae NY-K为研究对象,以提高木薯基质利用率为目标,最终构建含有三个独立表达盒的多基因酵母整合型表达载体,通过转化将葡萄糖淀粉酶基因、葡聚糖内切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因整合到NY-K基因组,从而赋予NY-K多底物代谢活性,从而在酒精发酵阶段兼具有水解淀粉的后糖化作用和降解纤维素活性,从而达到有效利用木薯基质中的淀粉和一定程度的降解进而利用纤维素的目的,最终提高木薯发酵酒精产率。 首先,构建了一个新型酵母整合型表达载体pYES2M。根据酿酒酵母(S. cerevisiae)磷酸甘油酸激酶基因启动子Ppgk碱基序列、核糖体rDNA碱基序列、酿酒酵母抗铜基因CUP1序列和毕赤氏酵母表达载体pPIC9K为模板设计引物,分别进行PCR,扩增得到Ppgk (GenBank accession No. FJ415226)、rDNA、CUP1和信号肽α-MF片段。以酵母附加型质粒pYES2为出发质粒,将扩增得到的4个片段依次引入pYES2中,构建得到表达载体pYES2M。以铜抗性作为筛选标记,避免了新的抗药性标记的引入,在源头上提高了安全性。 建立了以铜抗性为筛选标记的工业酿酒酵母转化子筛选方法,以及菌落PCR快速鉴定工业酿酒酵母转化子的方法。 之后,通过PCR方法从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中扩增得到葡萄糖淀粉酶基因gal,从绿色木霉(Trichoderma viride)中扩增得到葡聚糖内切酶基因eg3和p-葡萄糖苷酶基因bgl1。 通过点突变去除gal片段上Sph Ⅰ位点,通过PCR将eg3和bgl1内含子去除,分别将修饰后的gal、eg3和bgl1插入载体pYES2M的多克隆位点,构建得到三个酵母整合型单价表达载体pYES2M-ga1、pYES2M-eg3和pYES2M-bgl1。通过电转化将上述三个线性化载体整合到宿主菌S. cerevisiae NY-K基因组。功能鉴定及SDS-PAGE电泳检测表明三个重组酵母均向胞外表达了活性重组酶蛋白 其次,通过重叠延伸PCR将特定的基因串联起来,插入pYES2M的多克隆位点,构建了2个酵母双价整合型载体pYES2M-eg3-bgl1和pYES2M-eg3-ga1。其中eg3、bgl1和gal均自带完整表达盒。通过电转化方法将线性化载体pYES2M-eg3-bgl1、pYES2M-eg3-ga1分别整合到宿主菌S.cerevisiae NY-K基因组。酶活测定及SDS-PAGE电泳检测表明两个重组酵母均向胞外表达了独立的(非融合)有活性的重组酶蛋白。 最后,将葡萄糖淀粉酶表达盒pMFgaT插入载体pYES2M-eg3-bgl1中,得到含有3个独立表达盒的酵母整合型三价表达载体pYES2M-eg3-ga1-bgl1。通过电转化将线性化多基因表达载体pYES2M-eg3-ga1-bgl1整合到宿主菌S.cerevisiaeNY-K基因组。酶活测定及SDS-PAGE电泳检测表明重组酵母向胞外表达了独立的(非融合)有活性的重组酶蛋白。 整合gal基因的重组酿酒酵母能以可溶性淀粉为底物进行酒精发酵,发酵终点时酒精浓度为1.595g/00mL~1.614g/100mL,高于整合空载体的菌株NY-K/pYES2M和对照NY-K。整合了eg3基因的重组酿酒酵母能以为羧甲基纤维素底物进行酒精发酵,发酵终点时酒精浓度为0.220~0.259g/100mL,略高于整合空载体的菌株NY-K/pYES2M和对照NY-K。整合了bgl1基因的重组酿酒酵母能以为纤维二糖底物进行酒精发酵,发酵终点时酒精浓度为0.323-0.340g/100mL,略高于整合空载体的菌株NY-K/pYES2M和对照NY-K。 三价重组酿酒酵母NY-K/pYES2M-eg3-ga1-bgl1直接发酵木薯基质,发酵终点酒精浓度为1.64g/100mL,对照宿主菌为0.42g/100mL。木薯基质中添加外源酶制剂的基础上进行酒精发酵,三价工程菌NY-K/pYES2M-eg3-ga1-bgl1发酵终点时酒精浓度为9.14g/100mL,与双价工程菌NY-K/pYES2M-eg3-ga1酒精浓度(9.17g/100mL)无明显差别,其他单价和双价重组酿酒酵母发酵木薯基质酒精浓度在8.93~9.20g/100mL之间,对照宿主菌为8.68g/100mL。 以NY-K/pYES2M-eg3-eg3-bgl1通过SSF模式和SHF模式发酵木薯基质,产生的酒精浓度分别为9.27g/100mL和9.10g/100mL,SSF出酒率高于SHF。 综合以上结果认为,SSF发酵模式下重组酿酒酵母NY-K/pYES2M-eg3-ga1-bgl1的酒精度(9.27g/100mL)、淀粉利用率(93.79%)和出酒率(53.26%)基本达到酒精工业的要求,且生产过程能节约糖化酶等酶制剂用量,具有一定的应用价值。……   
[关键词]:燃料酒精;酿酒酵母;多基因转化;木薯;葡萄糖淀粉酶;葡聚糖;内切酶;β-葡萄糖苷酶
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:海南大学2011年