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抗李氏杆菌细菌素及李氏杆菌噬菌体内溶菌素CBD基因的克隆与表达

刘珊娜

  单核细胞增多症李氏杆菌作为食源性致病菌,对食品安全造成严重的威胁。控制李氏杆菌污染的有效方法之一就是在食品中添加细菌素。乳酸片球菌PA003产生的片球菌素是一种明显抑制李氏杆菌的细菌素。为了解决野生菌株片球菌素产量低的问题,实现片球菌素的高效表达,本研究将片球菌素结构基因pedA分别克隆到大肠杆菌及食品级乳酸乳球菌表达系统,进行异源表达;李氏杆菌噬菌体编码的内溶菌素是导致李氏杆菌裂解的因素之一,本研究将细菌素结构基因与内溶菌素中编码细胞表面结合蛋白(CBD)的基因构建到同一乳酸乳球菌表达载体,观察重组菌株吸附李氏杆菌并分泌细菌素的能力。 以乳酸片球菌PA003全基因组为模板将片球菌素的结构基因pedA扩增后插入到表达质粒pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,从克隆菌株中提取的重组质粒含有pedA基因,其核苷酸序列与NCBI公布的片球菌素pedA基因序列(GenBankAY083244)同源性为100%。重组菌株经诱导后,可高效表达预期大小的22kDa硫氧还蛋白和片球菌素的融合蛋白,表达形式为包涵体。用谷胱甘肽氧化还原系统的复性缓冲液处理后并采用Ni-IDA亲和重力柱分离纯化,在500mmol/L咪唑浓度下洗脱得到单一蛋白条带。融合蛋白经肠激酶酶切后得到与片球菌素大小一致的多肽,以李氏杆菌CVCC1595为指示菌,产量为512AU/ml培养液。采用相同的策略将扩增的pedA基因克隆到表达质粒pET20b(+)中,利用载体的pelB信号肽实现融合蛋白在胞内和细胞周质的可溶表达,片球菌素产量为384AU/ml培养液。 将乳酸乳球菌usp45信号肽序列和片球菌素结构基因pedA连接,分别插入到大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭质粒pMG36e的P32启动子和乳酸乳球菌食品级表达载体pLEB688的P_(45)启动子后的多克隆位点,得到的重组质粒转化至乳酸乳球菌NZ9000。重组菌液中检测到分泌的片球菌素,对李氏杆菌有抑菌活性。 将含有P_(45)启动子、usp45信号肽和片球菌素结构基因papA序列(P_(45)-SSusp45-papA),和含有P_(45)启动子、usp45信号肽和明串珠菌素C结构基因lecC序列(P_(45)-SSusp45-lecC)分别克隆到pBluescript/fliC H7质粒中,转化大肠杆菌JT1。重组大肠杆菌菌株能够分别分泌具有抑制李氏杆菌活性的片球菌素和明串珠菌素C的表达产物。 将CBD基因分别克隆到分泌片球菌素、明串珠菌素C的乳酸乳球菌表达载体,转化乳酸乳球菌GRS5,实现细菌素基因与CBD基因的共表达,获得的重组菌株具有同时吸附李氏杆菌和分泌细菌素的能力。在此基础上,通过菌体接合作用引入乳酸链球菌素产生和免疫基因,构建能够同时分泌片球菌素和乳酸链球菌素、以及明串珠菌素C和乳酸链球菌素的重组菌株,实现了两类细菌素在相同表达载体中的共表达。 本研究构建了硫氧还蛋白与片球菌素的融合蛋白在大肠杆菌细胞内以包涵体形式存在的及可溶性分泌的两种高效表达系统;实现了片球菌素在食品级表达系统乳酸乳球菌中的分泌表达;将CBD基因与细菌素基因在乳酸乳球菌中共表达,得到能同时吸附李氏杆菌和分泌具有抑菌活性的细菌素的重组乳酸菌;构建同时分泌乳酸链球菌素与片球菌素,乳酸链球菌素与明串珠菌素C的两种细菌素的乳酸乳球菌表达系统。以上研究为细菌素的生产提供了新的方法,对控制食品中的李氏杆菌,提高食品安全水平具有潜在的应用价值。……   
[关键词]:李氏杆菌;细菌素;融合表达;抑菌活性;细胞表面结合蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津大学2012年