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花生组织培养技术的优化研究

任艳

  花生是一种优良的经济作物。利用生物技术方法在花生中导入外源优良基因,是改良花生品质的有效方法,组织培养即是这样一种高效生物技术手段。利用组织培养技术构建花生高频植株再生体系是花生育种的关键,但由于植株再生率低、取材具有季节限制,并且花生的离体培养具有较大的基因型依赖性,品种间再生能力差别较大等多种因素的制约,很难获得高效、稳定、连续的再生植株。探索和完善高频率植株再生体系具有重要的理论和实际应用价值。 本研究以4个花生品种(普通型的大花生8130,珍珠豆型的小花生花育20,中间型的花育14和花育16)为目标,从灭菌方式的选择、不同外植体的选择、不定芽诱导、抗生素抑制细菌污染、壮苗、生根培养及炼苗移栽等多环节研究入手,以优化花生植株再生体系为目的,筛选及优化花生高频率植株再生体系的构建条件,建立和优化了花生的高频率植株再生体系,为花生遗传转化的进一步研究奠定基础。以期为研究结果发现: 1.花生种子灭菌适宜方法为:无菌条件下,用75%酒精浸0.5-1min,在1%次氯酸钠中浸泡10min,进行表面消毒,最后用无菌水洗涤3-4次,每次3-5min。这种方法灭菌效果好,对种子伤害少,负面影响也少。 2.不定芽诱导 2.1不同基因型诱导不定芽:不同基因型均能成功诱导不定芽。在基本诱导培养基B3N1中花生品种鲁花14和花育20的不定芽发生频率较高,分别为76.65%和75.81%。花育16和8130的不定芽发生频率较低,分别为52.2%和45.80%。 2.2不同外植体诱导不定芽:研究发现花生诱导不定芽的最佳外植体为萌发6d的胚小叶,其诱导生芽率明显高于其它外植体,不定芽诱导率为75%。萌发3d的胚小叶,长短只有1-2mm,不易切割,并且容易出现细菌污染和褐化,不定芽诱导率为72.5%;萌发9d的胚小叶,叶片逐渐张开,芽分化能力逐渐降低,不定芽诱导率为68.75%。上胚轴、下胚轴、子叶也诱导出少量的不定芽,其诱导率分别为3.75%、5%、7.5%。 2.3不同激素配比培养基对不定芽诱导培养的影响:基本诱导培养基B_3N_1中AgNO_3浓度2mg/L的处理萌发6d的花育20胚小叶不定芽诱导率最高达85%,玻璃化现象最低只有22.86%。诱导培养基N1在4个基因型中诱导频率都较高,普遍达到80%以上,在N1培养基中花育20不定芽诱导率最高,达89.2%。不同浓度NAA和TDZ和6-BA处理的T系列的培养基在花育20胚小叶的诱导试验中表现一般,最高诱导率只有73.91%,比N1培养基表现要差。说明T系列不是花育20胚小叶的最佳诱导培养基。 3.再生植株的壮苗、生根培养 3.1不定芽分化培养:分化培养基C6(5mg/L6-BA、4mg/LGA)中不定芽分化率最高,达86.67%。可作为花育20不定芽伸长的最佳分化培养基。 3.2多效唑在壮苗及生根培养中的应用:多效唑可以有效地抑制株高,形成壮苗,有效解决组培苗出现的苗茎细长和瘦弱等问题。当多效唑浓度是0.5mg/L时,是合适的壮苗浓度,当多效唑浓度过大,组培苗表现生长健壮,植株矮化严重。反而不利于壮苗。在花生生根培养基中,附加0.2mg/L多效唑效果为最好,根系发达,移栽苗成活率高。生根培养基中多效唑浓度超过0.2mg/L时,反而降低繁殖系数和成活率。因此,在花生组培快繁过程中,应兼顾试管苗健壮、繁殖系数高和移栽成活率高几个方面。 3.3抗生素对细菌的抑制效应:在花生组织培养苗继代培养基中添加一定浓度的医用抗生素可有效抑制细菌对培养基的侵染。在本实验所选用的5种抗生素中,羧卞青霉素对污染的组培苗抑菌效果最显著,60mg/L就能达到抑菌率100%,并且对组培苗的正常生长无显著影响,在花生组培中可以选用。而添加卡那霉素和利福平的处理,组培苗的叶绿素的合成明显受到影响,不建议选用。 3.4生根培养:在IR2生根诱导培养基上生根效果较好,生根率高,高达95.04%,根数多且长,生根部位愈伤组织小。移栽后成活率也最高,达47.31%。 4.炼苗移栽 不同基质移栽成活率比较,以沙∕蛭石∕土壤=1:1:1为基质的再生苗成活率最高,高达81.67%。……   
[关键词]:花生;组织培养;再生植株;继代培养;优化技术
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2012年