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红酵母合成类胡萝卜素及体外转化维生素A的研究

刘卉琳

  对从福建黄酒酒糟中分离出来的产色素菌株进行了鉴定、诱变、培养基和发酵条件的优化研究,并对该菌株所产类胡萝卜素进行了分离纯化与体外转化为维生素A的研究。主要研究结果如下: (1)于酒糟中分离得到一株产色素菌株。对该菌株所产色素进行定性分析,结果表明该色素为类胡萝卜素;对菌株进行常规形态和生理生化特性分析,结果表明该菌株为单细胞,呈椭圆形,芽殖;无子囊孢子;无假菌丝形成。在固体培养基上,菌落呈粉红色,菌落表面湿润、粘稠,边缘整齐,易被挑起;在液体培养基中,产生沉淀。葡萄糖发酵试验为阴性,硝酸钾试验为阳性,耐50%葡萄糖高渗试验为阴性,产类淀粉化合物试验为阴性,在37℃下可正常生长。利用26SrDNA D1/D2区域序列分析法对该菌株进行序列比对鉴定,结果表明,该酵母菌的序列与粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)模式菌株的序列同源性为100%。因此,结合该菌株形态特征和生理生化特性,确定该菌株为粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa),命名为RM-1。 (2)为获得类胡萝卜素高产菌株,利用N+离子注入法对粘性红圆酵母RM-1进行诱变处理,结果表明,当注入能量为10keV,注入剂量为2.0×1014ion/cm2时,经二苯胺的初筛和复筛所得突变株RM-127类胡萝卜素产量最高,与出发菌株RM-1相比,增加了66.79%。再经紫外诱变,得突变株RM-213,发酵试验结果表明,该菌株的类胡萝卜素产量达到10.59mg/L,较出发菌株RM-1提高了89.67%,传代试验表明,突变株RM-213遗传性状稳定,可作为工业生产菌种。 (3)以农业废弃物和副产物为发酵原料进行粘性红圆酵母RM-213发酵产类胡萝卜素的研究,经单因素试验、均匀设计试验和正交试验,获得了最佳的发酵工艺与参数。由单因素试验,得到最佳碳源为玉米秸秆水解液(50g/L),最佳氮源为玉米浆(40g/L)。通过均匀设计试验,得到影响发酵液中类胡萝卜素产量的几种添加物的回归方程为:Y=3.94+29.6X1+20.9X2-11.1X3-1.99X6,据此优化得到添加物及其最佳用量为:MgSO4·7H2O0.7g/L,K2HPO40.2g/L,乙醇0.7%,VB21.0g/L。通过正交试验,得出变温培养的最佳条件为0-40h培养温度30℃,40-72h培养温度24℃。通过正交试验对装液量、接种量、初始pH、摇床转速四个因素进行优化,优化结果为:装液量50mL/250mL、初始pH5.5、接种量10.0%、摇床转速170r/min。经过优化后的生物量(17.56g/L)、类胡萝卜素含量(1378.70gg/g)及产量(24.21mg/L)较未优化时(11.85g/L、891.34μg/g、10.56mg/L)分别提高48.19%、54.68%和129.26%。 (4)利用大孔树脂对粘性红圆酵母RM-213所产类胡萝卜素进行了分离纯化,得到了最佳的吸附和解吸条件。静态吸附试验结果表明,最佳吸附树脂为X-5树脂,当温度为25℃,吸附时间为1h时该树脂对类胡萝卜素吸附率最大,可达71.01%;最佳洗脱剂为乙醚,当温度为30℃解吸1h时,解吸率高达95.32%。动态吸附试验结果表明粘性红圆酵母RM-213产类胡萝卜素的最佳分离纯化工艺参数为:上样质量浓度以β-胡萝卜素计为111.82μg/mL,以1mL/min的流速通过径高比为1:9的层析柱,再用乙醚以0.5mL/min的流速洗脱。经纯化,类胡萝卜素纯度达到33.29%。 (5)对粘性红圆酵母液态发酵提取液成分β-胡萝卜素进行体外酶法转化试验表明该β-胡萝卜素经专一的β-胡萝卜素-15,15’-单加氧酶可转化为维生素A。通过对转化条件的优化研究,得出最佳转化体系为123mg/Lβ-胡萝卜素,3.5mmol/L脱氧胆酸钠,0.25%Tween40(w/v),pH8.0和0.5mmol/L d-a-生育酚。在此条件下,粘性红圆酵母液态发酵所产β-胡萝卜素在酶活力为2.69nmol mg-1h-1的β-胡萝卜素-15,15’-单加氧酶作用下于37℃水浴振荡反应7h,可再经硼氢化钠还原,转化成40.1mg/L维生素A,转化率达到61.11%(mol/mol)。……   
[关键词]:粘性红圆酵母;类胡萝卜素;发酵;分离纯化;β-胡萝卜素-15;15’-单加氧酶;维生素A
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南农业大学2012年