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小胸鳖甲抗冻蛋白酵母表达条件优化及应用研究

蔡文萍

  抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)最早是1969年Devries在极区海鱼血液中被发现,是一类抑制冰晶生长的蛋白质,能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值。这种差值称为热滞活性(thermal hysteresis activity, THA),因而AFP亦称为热滞蛋白(thermal hysteresis protein, THP)。具有三个基本特征:热滞效应(THA)、冰晶形态效应、重结晶抑制效应(RI),它广泛存在于多种生物体中,如鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌,其中昆虫抗冻蛋白是目前抗冻活性最高的一类抗冻蛋白。 昆虫抗冻蛋白一般认为是在脂肪体中合成,然后释放到血淋巴中通过氢键与冰晶结合阻止冰晶生长从而保护自身。对昆虫抗冻蛋白的研究起步较晚,研究发现许多陆生昆虫都存在抗冻蛋白,并且昆虫抗冻蛋白具有非常高的热滞活性。 小胸鳖甲(Microdera punctipennis)是分布于新疆荒漠极端环境中的拟步甲科昆虫,能耐受冬季的低温和春季剧烈的温差变化。其抵抗低温的机制与抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)的生物活性有关。 抗冻蛋白可广泛应用于农业、医学、食品、工业等科学领域。天然抗冻蛋白来源十分有限,因此获取高活性高质量的抗冻蛋白日益成为舆待解决的问题。由于昆虫抗冻蛋白独特的结构和生物学活性(分子量小,蛋白亚型多)给分离纯化天然昆虫抗冻蛋白带来一定的难度。通过基因工程技术已对少数昆虫抗冻蛋白进行了表达和纯化。由于高活性的昆虫抗冻蛋白p-螺旋结构的正确折叠需要众多二硫键的参与,因而细菌表达系统中往往不能表达具有正确构象的高活性昆虫抗冻蛋白或者是产生不可溶的包涵体蛋白,这类蛋白必须经过变性、复性、重折叠过程之后才能获得正确折叠的有活性的抗冻蛋白,且该过程往往需要较复杂的纯化方法,不适于大量生产。近年有用酵母表达系统来表达富含二硫键的昆虫抗冻蛋白的报道。但是到目前为止还没有获得生产活性抗冻蛋白的高产表达系统。因此采用基因工程技术获取昆虫抗冻蛋白仍是需要解决的问题。 巴斯德毕赤酵母表达系统具有如下优点:在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源,但不存在像细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题:具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境,使生产的蛋白具有天然的空间结构及生物学活性;有两个编码乙醇氧化酶基因:AOX1、AOX2,其中AOXI基因的表达主要受较高水平的甲醇诱导和调节。毕赤酵母既保持了酿酒酵母的优点,还能大幅度提高外源蛋白的产量。 本研究采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698,通过筛选高拷贝转化菌株,并对巴斯德毕赤酵母表达条件进行优化;同时对真核表达的MpAFP698的低温保护活性、酸碱及热稳定性进行测定;检测MpAFP698对小鼠脏器,昆虫卵细胞SF9及葡萄的低温保护作用。主要研究结果如下: 1.构建真核表达载体pPIC9K-Mpafp698,转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris,筛选获得重组子后甲醇诱导巴斯德酵母表达系统表达小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698。提取已经获得的酵母重组子基因组,PCR鉴定目的基因的整合及转化子的Mut表型,小量摇瓶发酵后取上清液作Tricine SDS-PAGE电泳和免疫印迹(Western blotting)分析。结果表明Mpafp698基因成功整合到宿主菌的基因组中,且所有的His+阳性转化子均为Mut+表型;经诱导发酵MpAFP698表达正确。 2.采用不同浓度G418抗性筛选高拷贝阳性转化子,诱导表达MpAFP698后对其蛋白浓度,THA, SCP,之间的相关性进行分析;并检测重组抗冻蛋白MpAFP698的耐酸碱性和耐热性,同时测定内源表达MpAFP698的酵母菌的耐寒性及外源添加MpAFP698对细菌的保护活性。在MD平板上筛选到His+阳性克隆,经G418抗性筛选,获得高拷贝阳性转化子;同时昆虫抗冻蛋白MpAFP698具有较强的热稳定特性,可以耐受100℃高温,并能维持10-15min而使活性变化不大。MpAFP698具有较强的酸碱稳定特性,可耐受极端酸碱环境。表达MpAFP698的酵母菌耐寒性显著提高;MpAFP698可显著提高菌体在-7℃及42℃的存活率。 3.对工程菌发酵甲醇诱导浓度、诱导时间及温度条件进行优化。研究表明,在甲醇浓度为1.0%,温度为25℃时,发酵时间为4d时MpAFP698的表达量最高。 4.检测低温条件下小胸鳖甲抗冻蛋白对小鼠脏器细胞形态、血细胞的溶血、昆虫SF9细胞存活率以及低温保存葡萄的影响,表明小胸鳖甲抗冻蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等的细胞形态,明显降低血细胞在4℃的溶血并提高SF9细胞冻融后的存活率;同时可显著提高不同葡萄品系4℃保存时的保水率。本研究为小胸鳖甲抗冻蛋白的大规模真核发酵研究提供了参考,同时为进一步揭示昆虫抗冻蛋白抗冻保护活性机理奠定了理论基础。……   
[关键词]:MpAFP698;巴斯德毕赤酵母;发酵;优化;性质;应用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆大学2012年