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槐猪精液NAGase的酶学性质与活力调控

章文

  以福建省地方品种槐猪精液为提酶材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱、Sephadex G-200分子筛柱和CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析,纯化获得聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳单一纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)纯酶制剂,比活力为2759.15U mg~(-1),回收率为7.88%。该酶等电点为8.9,经凝胶柱层析和SDS-PAGE测得酶分子量为71kDa,且只含有一个亚基。 酶水解对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-GlcNAc)的最适pH为5.7,最适温度为50℃,米氏常数Km和最大反应速度Vm分别为0.80mmol L~(-1)和25.16μmol L~(-1) min~(-1)。而酶水解P-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷(pNP-GalNAc)的最适pH为5.6,最适温度为55℃,米氏常数Km和最大反应速度Vm分别为0.24mmol L~(-1)和3.68μmol L~(-1) min~(-1)。酶在50℃以下,pH3.0-8.6范围内保持稳定。酶催化水解pNP-GlcNAc的活化能Ea为69.09kJ mol~(-1)。 以动力学方法和化学修饰法研究酶活性中心功能基团的性质。在37℃下测得NAGase活性中心解离常数pKe为5.29;解离热焓ΔHo为7.28kcal mol~(-1),结果表明与酶活性相关的可解离基团是组氨酸的咪唑基。酶在特定条件下通过修饰剂作用,测得酶分子链内二硫键、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基及赖氨酸的ε-氨基也是酶活性中心的必需基团,而精氨酸的胍基与酶活性无关。 酶催化pNP-GlcNAc的水解反应属于双底物双产物反应,研究产物的抑制动力学,根据Cleland规则探讨酶的催化作用机理,结果表明第一产物NAG表现为混合型抑制,而第二产物pNP类似物苯酚对酶没有影响,酶催化反应属于有序双双机理。 研究精清成分对NAGase的影响,结果表明:Na~+、K~+、Cl~-及低浓度的果糖对酶活力没有影响;HCO_3~-、PO_4~(3-)、碱性氨基酸、维生素B1和高浓度的果糖对酶活力有不同程度的抑制作用;柠檬酸对酶活力表现出先激活后抑制作用;而维生素C对酶活力则有显著的激活作用。进一步研究其作用机理,表明碱性氨基酸Lys、Arg、His和HCO-3为竞争型抑制,其抑制常数KI分别为16.92mmol L~(-1)、28.13mmol L~(-1)、77.43mmol L~(-1)和48.54mmol L~(-1);果糖为混合型抑制,其抑制常数KI和KIS分别为0.89mol L~(-1)和0.43mol L~(-1);PO3-4和柠檬酸为非竞争型抑制,其抑制常数KI分别为31.48mmol L~(-1)和63.58mmol L~(-1);维生素B1为反竞争型抑制,其抑制常数KIS为1.69mmol L~(-1);而维生素C则表现为部分竞争性激活。 研究微量元素对NAGase的影响,结果表明:Mn2+、Co2+及I-在低浓度下对酶活力有轻微的激活作用; Fe~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Cr~(3+)及高浓度的Mn~(2+)对酶活力有明显的抑制作用,其抑制程度依次为Cr~(3+)> Cu~(2+)> Fe~(2+)> Zn~(2+)> Mn~(2+);而亚硒酸钠对酶活力表现出先激活后抑制作用。进一步测定其抑制类型和抑制常数,表明Cr~(3+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)及Mn~(2+)均为反竞争型抑制,其抑制常数KIS分别为7.68μmol L~(-1)、0.11mmol L~(-1)、1.14mmol L~(-1)、3.15mmol L~(-1)和59.18mmol L~(-1),而亚硒酸钠表现为混合型抑制,其抑制常数KI和KIS分别为0.15mmol L~(-1)和0.53mmol L~(-1)。本文还研究表明,在Cu~(2+)和Zn~(2+)存在下,均能降低酶的热稳定性,此外脱金属离子螯合剂(EDTA2Na)对酶有激活作用。……   
[关键词]:槐猪精液;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;分离纯化;酶学性质;活力调控
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2012年