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β_1-肾上腺素受体自身抗体对大鼠B淋巴细胞增殖的影响及其可能机制

吕婷婷

  研究背景 心血管疾病是威胁人类健康的常见重大疾病之一,其病死率始终位于我国居民死因的首位,心血管疾病已成为我国的主要公共卫生问题。尽管现在的诊疗水平在不断提高,然而由于心血管疾病的病因繁多,病理机制复杂,其病死率、死亡率仍居高不下,提示在心血管疾病的发生发展过程中仍有未知因素参与。随着神经-内分泌-免疫网络学说的发展,免疫因素在心血管疾病中的作用日益受到众多学者的关注。1987年Wallukat等人首先在原发性扩张型心肌病患者血清中发现针对β_1-肾上腺素受体(β_1-adrenoceptor,β_1-AR)的自身抗体,即β_1-肾上腺素受体自身抗体(autoantibodies against β_1-adrenoceptor,β_1-AA)。随后,很多研究者又在恰加斯心脏病、原发性心电紊乱等多种心血管疾病患者血清中也检测到β_1-AA,并且其阳性率与滴度远远高于正常人群。随后的研究发现:β_1-AA可以与心肌细胞膜上的β_1-AR细胞外第二环(the second extracellular loop of β_1-adrenoceptor,β_1-AR-ECII,人鼠同源性为100%)结合,进而促进培养的乳鼠心肌细胞跳动频率增加、增强正常心房肌收缩、增加心肌细胞内的cAMP含量以及增加心肌细胞内Ca2+内流等,发挥着类似儿茶酚胺的作用。以上研究结果提示β_1-AA可能参与多种心血管疾病的病理生理过程。本课题组的前期研究结果发现:β_1-AA长期存在于大鼠体内时,在引起心脏结构改变、心功能降低的同时,还引起机体的抗体生成能力增加。抗体是由B淋巴细胞活化增殖、并经过一系列过程分化为浆细胞进而分泌的。有研究报道,外周血中B淋巴细胞数量的增加与心血管疾病的死亡率密切相关。因此,探讨β_1-AA是否对B淋巴细胞的增殖产生影响将为血清中β_1-AA阳性的心血管疾病患者的病理机制提供一定的理论依据。 第一部分β_1-AA对大鼠B淋巴细胞增殖的影响 目的 探讨β_1-AA是否对培养的大鼠B淋巴细胞的增殖产生影响。 方法 1. β_1-AA阳性血清的制备 用由吉尔生化上海有限公司合成的人β_1-AR-ECII(197~223,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A,人鼠同源性为100%,纯度大于95%)主动免疫大鼠获取β_1-AA阳性IgGs(positive IgGs, pIgGs),利用伪免疫组获取β_1-AA阴性IgGs(negative IgGs, nIgGs)作为对照。利用Mab Trap Kit试剂盒纯化血清中的总IgGs。纯化后的IgGs先经SDS-PAGE凝胶电泳检测其纯度,然后使用BCA蛋白定量试剂盒对总IgGs进行蛋白定量。 2. B淋巴细胞的获得 用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠脾脏中的淋巴细胞并用免疫磁珠分选(MagneticActivated Cell Sorting,MACS)技术获得B淋巴细胞;用流式细胞术检测B淋巴细胞的阳性率与活力;用RPMI1640完全培养液将B淋巴细胞培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。 3. CCK8试剂盒检测β_1-AA对B淋巴细胞增殖的影响 将pIgGs与nIgGs分别作用于静息B淋巴细胞和LPS刺激的B淋巴细胞,采用CCK8检测试剂盒检测β_1-AA对B淋巴细胞数量的影响。 结果 1.利用β_1-AR-ECII抗原肽段主动免疫大鼠获取β_1-AA 1.1主动免疫模型建立成功 β_1-AR-ECII抗原肽段初次免疫大鼠2周后,血清中β_1-AA的A值已由0.41±0.06升高到0.75±0.11(P=0.006,P<0.01)。并且,随着时间的延长,β_1-AA水平迅速升高并且8周时达高峰,A值达到3.01±0.020,且明显高于同期伪免疫组(A值为0.42±0.10,P=0.000,P <0.01)。以上结果提示:β_1-AR-ECII抗原肽段主动免疫大鼠模型建立成功,且免疫8周后进行大鼠腹主动脉采血并留取血清(图1)。 1.2β_1-AA蛋白定性及定量测定 用亲和柱试剂盒纯化血清中的总IgGs。用SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化的IgGs的纯度。结果显示,纯化的IgGs在SDS-PAGE凝胶电泳后出现两条带,一条表示IgG重链(55KD),另一条表示轻链(25KD),这两条带与IgG标准品相一致(图2),提示纯化效果理想。利用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化的IgGs浓度(图3及表1)。 2.成功分离大鼠B淋巴细胞 2.1MACS后大鼠B淋巴细胞的阳性率 用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠脾脏淋巴细胞经MACS分选后,流式细胞术检测B淋巴细胞的阳性率为92.7%(图4)。该结果提示大鼠B淋巴细胞分选成功。 2.2MACS后大鼠B淋巴细胞的活性测定 流式细胞术检测经MACS分选后大鼠B淋巴细胞的活细胞率为94.6%(图5)。 3. β_1-AA对静息的B淋巴细胞的数量无影响 0.1M pIgGs作用静息大鼠B淋巴细胞24小时后, A值变化无统计学差异(A值:0.320±0.012vs.0.309±0.011, t=0.060, P=0.524, P>0.05,图6)。该结果提示β_1-AA可能对静息B淋巴细胞的数量无改变。 4. β_1-AA促进LPS激活的B淋巴细胞增殖 0.1M pIgGs促进了LPS刺激的大鼠B淋巴细胞增殖(A值:0.739±0.036vs.0.533±0.032, P<0.05),0.1M β_1-AA阴性的IgGs(β_1-AA negative IgGs, nIgGs)却无此作用(A值:0.552±0.044vs.0.533±0.032, P=0.350, P>0.05,图7)。 当用β_1-AR-ECII将β_1-AA中和以后,与nIgGs相比,β_1-AA的促增殖效应消失(A值:0.552±0.044vs.0.560±0.048, P=0.238, P>0.05,图7);β_1-AR-ECII本身对活化B淋巴细胞的增殖无影响(A值:0.575±0.052vs.0.533±0.032, P=0.078, P>0.05,图7)。 以上结果提示,促进LPS激活的B淋巴细胞增殖是由β_1-AA引起的。 5. β_1-AA对LPS刺激的B淋巴细胞的增殖作用具有浓度依赖趋势 不同浓度β_1-AA(0.001M,0.01M,0.1M,1MpIgGs)干预LPS预刺激48小时的B淋巴细胞24小时后,与nIgGs组相比,A值分别由0.536±0.040、0.542±0.036、0.538±0.030、0.561±0.051增加到0.612±0.029、0.654±0.047、0.739±0.036、0.768±0.030,提示β_1-AA对LPS刺激的大鼠B淋巴细胞的促增殖作用有浓度依赖的趋势(图8)。 小结 β_1-AA可以促进LPS激活的大鼠B淋巴细胞增殖,并且该增殖效应具有浓度依赖的趋势;β_1-AA对静息B淋巴细胞的数量无改变。 第二部分β_1-AA致B淋巴细胞增殖的可能机制 目的 探讨β_1-AA致培养的大鼠B淋巴细胞增殖的可能机制。 方法 1. B淋巴细胞和CD4~+T淋巴细胞的获得 用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠脾脏中的淋巴细胞并用免疫磁珠分选(MACS)技术获得B淋巴细胞和CD4~+T淋巴细胞;流式细胞术检测MACS分选获得的这两种细胞的阳性率;利用Guava流式仪检测细胞的活力;培养方法同第一部分。 2. B淋巴细胞中β_1-AR的检测 用Real Time PCR技术检测B淋巴细胞中是否有β_1-AR的基因表达;用免疫荧光方法检测B淋巴细胞膜表面是否有β_1-AR的蛋白表达。 3. CCK8试剂盒检测B淋巴细胞增殖能力 β_1-AR阻断剂Metoprolol、β_2-AR阻断剂ICI118551、β_1/β_2-AR阻断剂Nadolol预孵育后利用CCK8法探讨β_1-AA致B淋巴细胞增殖是否通过β-AR受体途径起作用;β_1-AA作用72小时的、ConA刺激的CD4~+T淋巴细胞的培养上清液作用于静息B淋巴细胞24小时后,利用CCK8法探讨β_1-AA是否通过作用于CD4~+T淋巴细胞间接影响B淋巴细胞的数量。 结果 1. B淋巴细胞膜表面存在β_1-AR 1.1B淋巴细胞中有β_1-AR的基因表达 利用公司合成的β_1-AR、β_2-AR通过Real Time-PCR检测到B淋巴细胞中有β_1-AR与β_2-AR基因表达(图9)。 1.2B淋巴细胞膜表面有β_1-AR的蛋白表达 利用免疫荧光法检测到B淋巴细胞膜表面存在β_1-AR的蛋白表达(图10)。 2. β_1/β_2-AR共同参与介导β_1-AA致激活B淋巴细胞增殖作用 2.1β_1-AR参与介导β_1-AA致激活B淋巴细胞增殖作用 0.01M β_1-肾上腺素受体(β_1-AR)阻断剂Metoprolol预作用,可以部分阻断pIgGs的致激活B淋巴细胞的增殖作用(0.739±0.036vs.0.672±0.028, P=0.008, P<0.01,图11),但仍高于PBS溶剂对照组的0.533±0.032(P=0.000, P<0.01,图11);,Metoprolol本身无作用(0.533±0.032vs.0.523±0.036, P=0.695,P>0.05,图12)。该结果提示:β_1-AA可能部分通过B淋巴细胞膜表面的β_1-AR引起活化的B淋巴细胞增殖。 2.2β_2-AR参与介导β_1-AA致激活B淋巴细胞增殖作用 0.01M β_2-肾上腺素受体(β_2-AR)阻断剂ICI118551的预作用,使得A值由原来的0.739±0.036降低至0.638±0.03(3P<0.01),但仍高于PBS溶剂对照组的0.533±0.03(2P=0.000,P<0.01);ICI118551本身无作用(0.533±0.032vs.0.511±0.031, P=0.390, P>0.05,图12)。该结果提示:β_1-AA可能部分通过B淋巴细胞膜表面的β_2-AR引起活化的B淋巴细胞增殖。 2.3β_1/β_2-AR共同介导β_1-AA的致激活B淋巴细胞增殖作用 β_1/β_2-AR两种受体的非特异性阻断剂Nadolol的预作用使β_1-AA对活化B淋巴细胞的增殖效应消失(A值:0.528±0.062vs.0.533±0.032, P>0.05);Nadolol本身无作用(0.533±0.032vs.0.528±0.061, P=0.855, P>0.05,图12)。该结果提示:β_1-AA对LPS刺激的B淋巴细胞的促增殖作用可能是通过β_1-AR和β_2-AR信号通路共同介导的。 3. β_1-AA可能通过激活的CD4~+T淋巴细胞间接促进静息B淋巴细胞增殖 3.1大鼠CD4~+T淋巴细胞的获得及活性测定 用密度梯度离心法分离大鼠脾脏淋巴细胞经免疫磁珠分选后,CD4~+T淋巴细胞阳性率为92.7%(图13)。流式细胞术检测分选后的大鼠CD4~+T淋巴细胞的活细胞率>90%。 3.2β_1-AA激活的CD4~+T淋巴细胞培养上清液促进了静息B淋巴细胞增殖 PBS、0.1M pIgGs、0.1M nIgGs分别作用于刀豆蛋白A(ConA)刺激的CD4~+T淋巴细胞,72小时后取出三种培养上清液,并分别作用于静息B淋巴细胞24小时后,使得反应增殖效应的A值分别为0.460±0.033、0.480±0.054、0.552±0.055(F=6.061,P=0.012,P<0.05)。与PBS组相比,阴性IgGs组没有促进静息B淋巴细胞的增殖效应(0.480±0.054vs.0.460±0.033, P=0.483, P>0.05)。与nIgGs组相比,pIgGs组促进了静息B淋巴细胞的增殖作用(0.55±0.055vs.0.480±0.054, P=0.02, P<0.05)(图14)。该结果提示,β_1-AA可以通过作用于CD4~+T淋巴细胞间接引起静息B淋巴细胞增殖。 小结 β_1-AA可能通过B淋巴细胞表面的β_1/β_2-AR引起B淋巴细胞增殖;也可能通过作用于CD4~+T淋巴细胞间接导致静息B淋巴细胞增殖。 结论 β_1-AA既可能通过B淋巴细胞表面的β_1-AR/β_2-AR致活化B淋巴细胞增殖,也可能通过作用于活化的CD4~+T淋巴细胞间接导致静息B淋巴细胞增殖。……   
[关键词]:β_1-肾上腺素受体自身抗体;B淋巴细胞;增殖;CD4~+T淋巴细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山西医科大学2012年