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共振瑞利散射法和荧光法分析测定天然植物性激素及其分析应用研究

黎小艳

  天然植物性激素在现代农业、水果生产及园艺作物的组织培养的应用及潜在的抗癌药物开发中都具有重大意义。虽然已有的分析方法:UV法、电化学法、HPLC法、室温磷光法及质谱法等对研究6-苄氨基腺嘌呤,激动素等外源性细胞分裂素类物质与一些物质的相互作用提供了重要的信息,但是这些仪器昂贵,运行成本较高,而大多方法需要加热降解,操作繁琐。因此在使用这些大型仪器的同时,发展像RRS等仪器价廉、简便快速的方法来获取外源性细胞分裂素类物质与一些物质相互作用更加全面、更加丰富的信息是一项很有意义的工作。 本论文在国家自然科学基金项目(No.21175015)和重庆市教委科技项目(No.KJ101308)的资助下,对天然性植物激素的分析测定进行了如下几个方面的研究: 1.6-苄氨基腺嘌呤—铜(Ⅱ)—三苯甲烷类染料体系的吸收和共振瑞利散射光谱及其分析应用 在pH5.37-5.58的HAc-NaAc缓冲溶液中,6-苄氨基嘌呤(6-BA)与Cu(Ⅱ)反应生成螯合物,再与三苯甲烷类染料形成三元离子缔合物,其摩尔比分别为2:1(里斯沙明绿),3:1(固绿),2.5:1(水溶性苯胺蓝)。反应体系的吸收光谱发生变化,其共振瑞利散射光谱(RRS)和倍频散射(FDS)显著增强,三个体系的最大RRS峰均位于372nm附近,6-BA浓度在一定范围内的增加与相应的RRS强度(ΔIRRS), FDS(AIFDS)强度和吸光度(ΔA)均成线性关系。其RRS检出限分别为5.48ng·mL-1(里斯沙明绿),18.43ng·mL-1(固绿),9.34ng·mL-1(水溶性苯胺蓝)。据此建立6-BA—Cu(Ⅱ)—里斯沙明绿染料体系测定痕量6-BA的RRS法,并用于豆芽中6-BA的快速测定,结果令人满意。此外,本文还应用了计算化学软件Gaussview3.07和Gaussian03W软件,采用密度泛函法,在B3LYP/6-31G基组水平上计算了6-BA的电荷分布,并对里斯沙明绿体系的反应机理及RRS增强的主要原因进行了初步探讨。 2.Na2W04-6-苄氨基腺嘌呤螯合离子与罗丹明6G的相互作用对共振瑞利散射光谱和荧光光谱的影响及其分析应用研究 在常温下,pH=4.9~6.06的B-R缓冲溶液中,6-苄氨基嘌呤(6-BA)与Na2WO4配位形成1:1的螯合阴离子[6-BA·WO4]2-,它能进一步与罗丹明6G阳离子反应形成三元离子缔合物,引起共振瑞利散射(RRS)急剧增强并产生新的RRS光谱,同时溶液荧光急剧猝灭。体系荧光的最大激发(λex)和发射波长(Aem)分别位于290nm和559nm,最大RRS峰位于316nm附近。在一定范围内,散射增强(ΔIRRS)与荧光猝灭程度(ΔIF)均与6-BA的浓度呈线性关系。据此可建立RRS法和荧光猝灭法测定痕量6-BA,在优化的条件下,两种方法测定6-BA的线性范围和检出限分别为:0.05-15.00μg·mL-1和8.2ng-mL-1(RRS),0.50-15.00μg·mL-1和17.0ng·mL-1(荧光猝灭法),而RRS方法明显优于荧光猝灭法。本文重点考察了RRS及荧光猝灭法适宜的反应条件和影响因素;用RRS法考察了共存物质的影响,表明方法具有良好的选择性;并用于黄瓜与青椒中痕量6-BA的测定,结果令人满意;本文采用密度泛函法,在B3LYP/6-31G基组水平上计算了6-BA的电荷分布,并对三元离子缔合体系的反应机理进行了初步探讨;利用偏振同步光散射信号,讨论了离子缔合反应的同步光散射偏振度,从而分析了其共振散射光的构成并分析了RRS增强的主要原因。 3.激动素诱导芳香族氨基酸的荧光光谱变化研究 本研究建立了一种灵敏度高、简便、快速测定痕量激动素的方法。采用荧光猝灭法研究了室温下(12℃C~30℃),pH2.02~3.79BR缓冲介质中激动素与芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸相互作用的荧光光谱特征。三个体系标准曲线的相关参数为:KT—D-Trp体系线性范围为0.025μg/mL~2.8μg/mL,相关系数(r)为0.9959、KT—D-Tyr体系线性范围为0.050μg/mL-2.5μg/mL,相关系数(r)为0.9967、KT—D-Phe体系线性范围为0.25μg/mL-10.0μg/mL,相关系数(r)为0.9955。以灵敏度相对较高的KT—D-Trp体系进行了应用实验:进行了柿子和李子表皮中激动素的测定,相应的回收率分别为92%-110%;90%-102%,其对应的RSD分别在0.58%至4.64%,0.39%至2.77%之间。 4.激动素对牛血清白蛋白及人血清蛋白荧光光谱的影响研究 应用荧光光谱法研究了室温下,pH=7.00的BR缓冲溶液中牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)分别与激动素的相互作用。荧光光谱显示,激动素能引起BSA和HSA的内源荧光猝灭。BSA和HSA的浓度分别为3.79x10-7-7.58×10-7mol/L和3.76×10-7-7.52×10-7mol/L时与激动素均只有一个结合位点,静态猝灭结合常数分别为:1.14×104L/moL和0.42×104L/moL。KT-BSA体系和HSA-KT体系猝灭程度(ΔF)在一定范围内均与KT的浓度增加成正比,KT-BSA体系和HSA-KT体系标准曲线的相关参数分别为:检测限为1.63×10-7mol/L和1.79×10-7mol/L;线性范围为9.28×10-6mol/L-8.12×10-5mol/L和9.28×10-6mol/L-1.04×10-4mol/L;相关系数为0.9941和0.9991。以KT与两种蛋白质不同的摩尔比作用的紫外光谱来讨论KT对于血清蛋白构象变化的影响;考察了共存物质的影响,表明方法有良好的选择性,可用于市售番茄、苦瓜及葡萄样品表皮中激动素的测定。此外,通过研究温度对体系荧光强度的影响以及Stern-Volmer作图,判断该反应以静态猝灭反应为主。……   
[关键词]:共振瑞利散射光谱;荧光光谱;6-苄氨基嘌昤;激动素;芳香族氨基酸t血清白蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2012年