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羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

李继连

  羊附红细胞体病是一种人畜共患病,其病原体为羊附红细胞体(E.ovis)。为了准确快速诊断该病,为及时进行有效防治提供技术支撑,本试验探索一种准确高效的羊附红细胞体特异性抗原制备技术,以此建立特异、灵敏的双抗体夹心ELISA检测方法。 采集红细胞感染率>90%的羊附红细胞体阳性抗凝血,分别应用水浴法和药物体外驱虫法对羊附红细胞体进行解离,观察分离前后附红细胞体感染率(%)、红细胞感染强度(个)、附红细胞体数(1×104/mm3)、杂质含量和附红细胞体的运动性五项指标;提取附红细胞体抗原,制备全蛋白悬液,测定蛋白质含量,比较解离效果。将两种方法制备的羊附红细胞体抗原全蛋白进行SDS-PAGE试验,观察条带是否一致。结果显示,200mL血液中加入1mL双向红链灭,4℃作用36h,即可达到较好分离效果。与水浴法相比,解离后,红细胞感染率和感染强度明显下降,蛋白含量增加,收率高,纯度好。SDS-PAGE结果显示,体外驱虫法所制备的附红细胞体抗原全蛋白悬液,其抗原蛋白带与水浴法相同。 应用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原全蛋白,采用切胶技术、水平电泳技术和透析方法将其纯化后,再应用SDS-PAGE和免疫印迹试验筛选出有免疫原性的特异性抗原蛋白成分。再次纯化这些成分,并免疫家兔,制备并提纯抗体,进一步建立特异、灵敏的血清学检测方法—双抗体夹心ELISA方法。结果表明,粗制抗原主要由4条带组成,纯化后经分析分子量分别为115.35kDa,74.13 kDa,68.87 kDa,32.96 kDa。免疫印迹试验中,只分子量为115.35kDa和68.87 kDa的两条带与阳性血清反应,因此认定为羊附红细胞体特异性抗原蛋白。其余两条带或只一部分成阳性,或不反应。双抗体夹心ELISA试验结果表明,特异性免疫抗原蛋白浓度为1.8mg/mL,免疫家兔35天后,兔血清抗体效价高达1:5120;敏感性试验结果显示抗原最低检出量为3.55μg/mL,较应用粗制抗原制备抗体建立的ELISA方法敏感度提高。特异性试验结果显示,纯化抗体只与羊附红细胞体反应,而与肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌不反应;由交叉性试验结果可见,用纯化抗体检测抗原时,只有羊附红细胞体呈阳性反应,不与其他动物附红细胞体的抗原反应,说明本试验特异性好。 从张家口地区某些羊场采取血样100份,应用本检测方法进行检测,结果羊附红细胞体阳性率为79%,优于镜检法(阳性率为62%),差异显著(P<0.05)。……   
[关键词]:羊附红细胞体;体外驱虫;特异性抗原;切胶纯化;双抗体夹心ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年