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重组酵母GS115/PSD,GS115/CEC的构建及其对水果采后病害抑制效果的研究

任雪艳

  由真菌病原菌引起的果实采后病害对人们造成了严重的经济损失。用拮抗酵母取代化学杀菌剂,或降低化学杀菌剂的使用量(即生物防治BCPD),具有良好的应用前景,但是普通拮抗菌很难达到化学杀菌剂的杀菌效果,因而筛选新型拮抗菌或提高原有拮抗菌拮抗效力成为了该领域的研究热点。通过基因工程技术改造拮抗酵母从而提高其生防效果是果蔬采后病害生物防治的新方法。本文探讨了将抗菌肽基因转移到酵母中表达以提高其生防效果的方法,成功的将外源抗菌肽基因CecropinA和PsdI在毕赤酵母中进行表达并对重组酵母GS115/CEC、GS115/PSD的安全性及对果蔬采后的主要致病菌和果蔬真菌病原菌引起的腐烂的抑制效果进行了研究;探讨了该酵母与外源物质结合使用对果蔬采后病害抑制效果的影响;初步研究了该酵母对果蔬致病菌的抑制机理及对果蔬贮藏后品质的影响,其主要研究结果如下: (1)根据已报道基因序列合成抗菌肽Cecropin A和PsdI基因片段,并将其连接到PGEM-T载体上。在此基础上将目的基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建毕赤酵母表达载体。将其线性化后,用电转化法导入Pichia Pastoris GS115中。采用G418进行梯度筛选高抗性转化子。以甲醇作为诱导物,取发酵培养3d后的发酵上清液,进行Tricine-SDS-PAGE验证了基因表达的正确性。并且经接种培养、诱导发酵及PCR鉴定等验证了重组酵母具有良好的稳定性。 (2)通过对重组毕赤酵母GS115/CEC、GS115/PSD发酵过程的两个阶段发酵条件的优化实验,得出生长阶段优化后的发酵工艺为:甘油2%,硫酸铵2%,pH=6.5-7.5,30℃条件下培养72h。外源基因诱导表达阶段优化后的发酵工艺为:甲醇1%,硫酸铵2%,pH=7.0,30℃条件下培养72h。采用正交实验来优化毕赤酵母的发酵条件,其影响发酵的主要因素及影响的大小依次为:温度>甲醇浓度>发酵天数>溶液pH值。最终得到重组毕赤酵母发酵过程中各项影响因素的优化值,即pH5.5,甲醇浓度为1%,温度为30℃,时间为4d,在优化后的发酵条件下,重组酵母GS115/CEC、GS115/PSD表达的外源蛋白含量平均可达15.1及11.3 mg/L。 (3)利用重组酵母对4种果实的4种主要采后致病菌进行了体外及体内生防实验:平板抑菌实验及液体抑菌实验均表明重组酵母在体外对病原菌有广谱抑菌活性;实验表明该重组酵母可显著抑制链格孢、灰葡萄孢在番茄果实上的侵染;抑制扩展青霉引起的苹果及梨的腐烂;抑制灰葡萄孢引起的梨和苹果腐烂。同时实验表明,重组酵母对病原真菌的抑制效力与其细胞悬浮液的浓度有关,浓度越高,对致病菌的抑制作用也越强。 (4)对重组酵母抑菌机理的研究结果表明,抑菌机制除体现了传统的营养与空间的竞争外,采用扫描电镜、透射电镜观察发现表达抗菌肽基因的重组酵母处理的真菌外部形态和内部结构都发生了很大的变化,出现了畸形,破裂,断残等现象。证实了其对真菌的膜结构及细胞内部结构的损坏作用。 (5)在以上工作的基础上,进一步从分子水平研究了表达抗菌肽基因的重组酵母对真菌的作用机制。凝胶阻滞实验证明,抗菌肽能与真菌的RNA结合,影响了它们在电泳中的迁移率,同时还能使真菌的DNA及RNA降解,因而真菌细胞的代谢过程受到破坏,最终导致了真菌的死亡。此外,重组酵母能诱导与果实抗性相关的PR蛋白过量表达,因此诱导果实的自身抗性可能也是抑菌机制的一部分。 (6)重组酵母能和外源物质相结合,显著增强对果实采后病害的防治效果:重组酵母和适当浓度金属盐类(氯化钙)、碳酸盐及乙醇结合使用,能降低果实的腐烂率;采后水果腐烂率显著低于1×108 cells/mL GS15/CEC单独处理的水平。 (7)用重组酵母GS115/CEC、GS115/PSD的干粉制剂进行了食品级小鼠急性经口毒性实验,初步确定该制剂属于实际无毒类。经重组酵母处理的樱桃番茄果实,其在贮藏期间的品质指标与对照果实相比,没有明显的差异。……   
[关键词]:毕赤酵母;抗菌肽;重组酵母;采后病害;生物防治
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2012年