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配体介导的非病毒基因载体的研究

姜启英

  在过去的20年中,人工合成的阳离子脂质体和聚合物作为基因载体已被广泛应用于肿瘤治疗的研究中,然而,外源基因如何进行转运及影响基因转运的因素等机制问题还没有被明确阐明。根据基因转运的一般过程,可将阻碍基因转运的因素分为细胞外环境屏障和细胞内屏障。要使外源基因能够导入细胞并表达,首先,必须保证外源基因在细胞外不受破坏,不被核酸酶所降解,并有效的到达靶细胞,经细胞内吞进入溶酶体,再通过溶酶体逃逸进入胞浆,然后转运至细胞核内进行表达。本文运用不同配体对载体材料进行修饰,制备形成具有靶向或双功能基因载体,并对载体的靶向性及基因转染能力进行验证。 具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和降血糖等多种生物活性的天然植物多糖受到越来越多的研究者的青睐,并已经开始运用于非病毒基因载体的研究中。本文将从薏苡仁种子中提取的薏苡仁多糖(Coixan polysaccharide,CP)与小分子量的聚乙烯亚胺(PEI 1200Da)偶联形成可携带DNA的聚合物载体,并用靶向配体叶酸对聚合物修饰。对合成产物CP-PEI-FA进行各种表征,检验聚合物的DNA缩合能力,粒径和ξ电位、细胞毒性和转染效率。MTT实验证明CP-PEI-FA相对于PEI25 kDa具有非常低的毒性,与PEI 1200毒性接近。基因转染实验结果显示CP-PEI-FA对叶酸受体表达阳性细胞C6和HeLa具有高的转染效率,证明了CP-PEI-FA对叶酸受体的靶向性。值得注意的是,在体内分布实验中CP-PEI-FA能有效的将DNA转运至肿瘤组织并使基因表达。以上结果显示,CP-PEI-FA无论在体内和体外都显示出非常好的基因转染能力。 细胞膜是外源基因进入细胞的第一道障碍,为了克服细胞膜屏障,本文还联合运用靶向配体叶酸和细胞穿膜肽R8对阳离子骨架材料聚乙烯亚胺-β-糊精(PEI600-CD, PC)进行修饰后,与DNA形成了双功能复合物FA-PC/R8-PC/DNA-L,体内实验和体外实验结果都显示FA-PC/R8-PC/DNA-L能在与叶酸受体阳性细胞靶向结合且更容易跨越细胞膜到达胞浆内,从而提高转染效率。 最后,本文将兼具靶向和穿膜作用的短肽CC9,按照不同的摩尔比与聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI600-CD, PC)偶联,并对合成产物PC-CC9与DNA形成的复合物进行MTT,粒径、ζ-和、体内和体外转染效率的检测。对两种方法形成的复合物PC/DNA+CC9 (CC9偶联)和PC/DNA+CC9 (CC9混合)的转染效率进行了比较,结果显示,两种复合物靶向性和转染效率无显著性差异,PC/DNA+CC9较PC-CC9/DNA稍好。本文还用流式细胞仪对转染PC-CC9/miRNA-34a.eGFP和PC/miRNA-34a.eGFP+CC9的PANC-1细胞进行细胞周期和细胞凋亡的分析检测,检验miRNA-34a对肿瘤细胞生长的影响。Westen Blot和qRT-PCR实验结果显示PANC-1细胞转染PC-CC9/miRNA-34a.eGFP和PC/miRNA-34a.eGFP+CC9复合物后,细胞内与BCL-2、E2F3、CyclinE2和c-myc相关的miRNA和相应蛋白表达水平都有所降低。 靶向配体和细胞穿膜肽的联合运用,有助于提高复合物对肿瘤细胞的靶向性和进跨越细胞膜障碍的能力,减小对正常组织的毒副作用,提高药物的生物利用度,为基因载体的发展提供了新的思路。……   
[关键词]:基因载体;聚乙烯亚胺(PEI);β-环糊精;多糖;细胞穿膜肽;靶向;miRNA-34a
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2011年