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砀山酥梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)转入抗病相关基因VpSTS和VpPR10的研究

孟颢光

  梨是世界上最重要的温带水果之一,属于蔷薇科,广泛种植于温带和亚热带地区。在梨树传统的杂交育种中存在许多问题,这些问题包括童期长、杂合程度高和在育种选育中需要种植的面积大,这些不利条件严重阻碍了其育种进程。近年来,随着植物基因工程的不断发展,特别是农杆菌介导的遗传转化方法在作物育种上的广泛应用,就可以将外源的具有经济价值的基因整合进目标作物,为改良其某一性状提供资源。农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料的再生能力及农杆菌的转化效率,因此,建立良好而高效的再生体系是遗传转化成功的关键。 本试验以砀山酥梨离体叶片为材料,研究基本培养基类型、激素种类和浓度配比、接种方式、苗龄、暗培养时间和硝酸银对砀山酥梨离体叶片再生不定芽的影响,优化了砀山酥梨离体叶片的再生体系,并在此基础上建立农杆菌介导的遗传转化体系。通过农杆菌介导法将来源于华东野生葡萄(Vitis pseudoreticulata W. T. Wang)的株系“白河-35-1”的VpSTS和VpPR10基因导入砀山酥梨的基因组中。取得了以下主要结果: 1.建立了砀山酥梨离体叶片再生体系 比较了6种基本培养基,MS、1/2MS、QL、NN69、WPM和B5,NN69基本培养基适合砀山酥梨离体叶片的再生。BA(3.0 mg/L)和IBA(0.2 mg/L)组合对不定芽的再生有很好的促进作用。 一定时间的暗培养也能促进砀山酥梨不定芽的再生,一般以3周的暗培养处理效果最佳;不同的叶龄的叶片不定芽再生率有显著的差异,25 d叶龄的叶片得到的再生率最高;叶片远轴面向下接触培养基;再生培养基中附加0.5 mg/L的AgNO3对砀山酥梨的不定芽再生都有显著地影响。 2.构建了植物表达载体pWR-II-VpPR10 将质粒pCAMBIA1300和pWR306经限制性内切酶HindⅢ/EcoRⅠ双酶切后,再定向连接,得到含有ED35s启动子、Omega元件、MCS及TNOS终止子的中间表达载体pWR-Ⅱ;再将质粒pWR-Ⅱ和pGEM-Teasy-VpPR10经限制性内切酶BamHI/SalI双酶切后,再定向连接,得到以潮霉素作为筛选标记基因的植物表达载体pWR-II-VpPR10,并用改进的冻融法导入根癌农杆菌EHA105。 3.建立了砀山酥梨的遗传转化体系 在砀山酥梨的转化体系中,潮霉素的筛选临界浓度为5.0 mg/L,头孢霉素抑菌浓度为300 mg/L。 试验中研究了一些影响转化的因素:菌液浓度和侵染时间、共培养时间、AS浓度等等。得到了转化最优方案:菌液浓度OD600为0.5,侵染5 min,共培养48 h,AS浓度100μM,延迟5 d的筛选方式。 采用两步生根法诱导转基因植株生根,试管苗在附加80 mg/L PG、20 mg/L IBA的ASH基本培养基上暗培养7 d后转入附加80 mg/L PG的ASH培养基上进行光照培养,生根率达到91.7%。4.转基因植株检测 潮霉素的抗性植株经过PCR检测、Southern blot杂交检测和RT-PCR检测,证明VpSTS和VpPR10基因已整合到砀山酥梨基因组中,对转VpSTS基因呈阳性的植株进行进一步的高效液相色谱(HPLC)检测显示,其中的3个转基因株系中白藜芦醇的含量分别为1.50μg/g(鲜重)、2.137μg/g(鲜重)、1.931μg/g(鲜重),而非转化植株中没有检测到白藜芦醇。……   
[关键词]:梨的遗传转化;农杆菌介导法;芪合酶基因;病程相关蛋白10基因
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2011年