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肉制品和乳制品中致病菌检测技术体系建立及李氏菌分型鉴定与溯源研究

王耀

  肉制品和乳制品中的多种致病菌是影响食品安全和威胁人类身体健康的重要因素。目前国内外对肉制品和乳制品中致病菌的检测方法还多停留在检测效率低、目标单一的水平上。本研究采用DNA聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)高通量检测方法,对肉制品和乳制品中多种致病菌的高通量检测、属种鉴定、血清分型、流行株检测等检测技术进行了系统研究,搭建相应技术平台。并且通过应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS),对单核细胞增生性李斯特氏菌的鉴定分型和溯源进行了系统的研究。本研究取得的试验结果如下: 1.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了针对肉制品中常见的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、D溶血性链球菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌等10种致病菌的单一致病菌的PCR-DHPLC检测方法,并且建立了可以同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、β溶血性链球菌等六种致病菌的多重PCR-DHPLC高通量同步检测方法和四种致泻性大肠杆菌的多重PCR-DHPLC高通量同步检测方法。 2.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了乳制品中常见的阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌、致病性嗜水气单胞菌等8种致病菌的各单一致病菌的快速高通量检测方法。并且建立了可同时检测阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌等四种致病菌的多重PCR-DHPLC检测方法以及奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌、致病性嗜水气单胞菌等四种致病菌的多重PCR-DHPLC检测方法。 3.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,通过设计并筛选出特异性的引物,在菌属的水平上,建立了食品中李斯特氏菌属的PCR-DHPLC快速检测方法。 4.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了食品中李氏菌三种致病菌即单核细胞增生性李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的多重PCR-DHPLC高通量检测方法。 5.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了食品中单核细胞增生性李斯特氏菌血清型中临床感染率高的主要血清型(1/2a和4b)的分型多重PCR-DHPLC高通量检测方法。 6.以单核细胞增生性李斯特氏菌的流行株分类(ECⅠ、ECⅡ、ECⅢ)为检测对象,应用DHPLC的非变性条件下的鉴定技术,在流行株分类的水平上,在国内外首次建立了食品中单核细胞增生性李斯特氏菌流行株分类的高通量检测方法。 7.以李斯特氏菌属的6个分类菌种(单核细胞增生性李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌)为检测对象,应用DHPLC的部分变性条件下的高通量分型鉴定技术,在属以下的菌种分类水平上,在国内外首次建立了食品中李斯特氏菌属6个分类菌种的高通量分种鉴定方法。 8.本研究收集了37株单核细胞增生性李斯特氏菌分离株,应用MALDI-TOF-MS采集获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,在国内外首次建立了单核细胞增生性李斯特氏菌鉴定数据库。并且在数据库信息的基础上,对37株单核细胞增生性李斯特氏菌分离株进行了聚类分型和溯源研究。 综上所述,本研究在国内外首次建立了肉制品和乳制品中多种致病菌的PCR-DHPLC快速、精准、高通量同步检测技术体系,并且建立了单核细胞增生性李斯特氏菌的MALDI-TOF-MS鉴定数据库,开展了系统的单核细胞增生性李斯特氏菌的聚类分型和溯源研究。上述研究成果对于食源性致病菌的快速鉴定和主动监测以及重大食源性疾病的预防和溯源具有重要的意义。……   
[关键词]:肉制品;乳制品;致病菌;DNA聚合酶链式反应;变性高效液相色谱;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:沈阳农业大学2011年