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家蚕细胞周期蛋白家族基因的表达特点及功能分析

刘丽华

  细胞周期蛋白(Cyclin)是一种与细胞周期相关的核蛋白,从酵母到人类等真核生物中都具有广泛作用。Cyclins周期性积累与分解对细胞周期进程起关键作用。Cyclins通过依次激活相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclindependent kinase,CDK),多层次有序调节细胞周期。Cyclins还决定CDK底物的磷酸化,驱动细胞通过细胞周期的各时相或检测点,推动细胞周期的进程。在细胞的增殖、分化及肿瘤发生中起重要作用。 在家蚕(Bombyx mori)中共发现5种细胞周期蛋白,即Cyclin A、B、B3、L1、E。本研究以家蚕为研究对象,对家蚕细胞周期蛋白家族基因的表达特点及Cyclin E基因的功能进行了分析,获得的主要结果如下: 1、家蚕细胞周期蛋白家族基因的克隆及结构特征与表达分析 利用家蚕基因组数据库信息设计引物,分析Cyclins在家蚕中的表达情况。分别克隆了5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,Cyclin A、B、B3基因分别有7个外显子,Cyclin E基因有8个外显子,Cyclin L1基因只有1个外显子。CyclinA及CyclinE基因存在较多的剪切方式,CyclinA基因主要包含大小为2 141 bp和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7个外显子,CyclinE基因则含有1 422 bp、1 290 bp及1 194 bp等6个大小不同的序列,变化集中于第5~7外显子,而CyclinB、B3、L1基因则相对稳定。对蛋白序列进行分析表明,这5种周期蛋白都具有典型的周期蛋白盒序列,CyclinA、B、B3、L1都有2个连续的周期蛋白盒,CyclinE只有1个周期蛋白盒。Cyclins家族基因的表达存在组织特异性,CyclinA基因只在精巢中表达,CyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,CyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,CyclinB和CyclinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究细胞周期蛋白在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。 2、家蚕CyclinE基因在5龄幼虫组织表达的剪切变体和表达特征 为研究CyclinE基因在家蚕不同组织中的表达情况,克隆了家蚕CyclinE基因在5龄幼虫不同组织表达的cDNA序列,在不同组织中获得该基因的6种不同剪切变体,这6种剪切变体前4个外显子和最后一个外显子都相同,变化主要集中在5~7外显子处。这些结果提示,不同组织中表达的CyclinE基因剪切体不同,可能与特殊的细胞周期类型或者特定的细胞周期阶段有关,多样而独特的CyclinE-CDK2复合物可能调节不同组织在特定发育中的细胞周期进程。同源性比较显示,不同物种来源的CyclinE周期蛋白盒具有较高的保守性,有35个氨基酸为共同保守序列。利用实时定量PCR分析显示,CyclinE基因在家蚕5龄第3天各组织中均有表达,并且在脂肪体中的表达相对较高。研究结果可为进一步探讨家蚕CyclinE基因在家蚕生长发育过程中的生物学功能提供参考。 3、家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄3天幼虫组织中的表达 采用实时荧光定量PCR方法检测了家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄3天幼虫组织中的转录水平。结果显示,在丝腺中,CyclinE基因大量表达, CyclinA、L1基因表达较弱,而CyclinB、B3基因没有检测到表达。家蚕丝腺细胞属于核内有丝分裂细胞,在G1期和S期之间不断转换,其间不经过G2期和M期的转换。此结果表明,CyclinE基因在丝腺细胞中G1/S期起重要作用。而CyclinB、B3基因在G2/M期起作用。同时也检测了其他几种组织中CyclinA、B、B3、L1基因的转录水平。结果表明,CyclinA、B、B3、L1基因都在精巢中高表达,推测这几个基因在家蚕精巢中的精母细胞发育形成精子进行分裂时起着重要作用。 4、CyclinE基因干扰RNA对家蚕细胞增殖的影响 为了研究siRNA抑制家蚕CyclinE基因表达后,对BmN细胞增殖及细胞周期的影响。化学合成针对CyclinE基因的干扰RNA小片段,通过脂质体转染家蚕BmN细胞,应用实时荧光定量PCR法测定siRNA干扰后CyclinE mRNA水平,流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期分布。结果表明,转染siRNA后, siRNA-1 252(针对1252nt开始的mRNA序列)和siRNA- 568分别使BmN细胞CyclinE mRNA水平降低了68%和90% ;流式细胞仪检测结果显示,G0/ G1期细胞比率增多,S期和G2/M期细胞比率减少。结果表明,在家蚕BmN细胞中导入siRNA有效地抑制CyclinE基因的转录,使细胞增殖减缓。验证了CyclinE基因在细胞周期的G1/S期起重要作用。同时,发现针对CyclinE基因不同部位设计的siRNA,下调CyclinE基因的效果不同,568位点比1 252位点干扰效果显著,推测siRNA的基因沉默效果除了严格遵从编码碱基的选择设计原则外,可能还与基因编码区域的选择靶点相关。 5、外源物质对家蚕BmN细胞周期蛋白家族基因转录水平的影响 为了研究家蚕BmN细胞周期蛋白家族基因在受到外源物质影响下的表达变化,本文选取了BmNPV和蛹虫草水提取液作为刺激物,添加到家蚕BmN培养基中,利用荧光定量PCR技术检测BmN细胞周期蛋白家族基因在转录水平上的变化。结果显示,在BmNPV感染0~12 h时,Cyclin家族各基因表达水平都明显下降, CyclinB3和CyclinA基因表达量降到最低点。在12~24 h,CyclinB和CyclinL1基因表达量显著下降,CyclinE基因表达变化平缓,并且CyclinB基因表达量下降到最低值,在24~36 h,CyclinE和CyclinL1基因表达量下降到最低值。36 h以后,Cyclin家族各基因表达量变化平缓,没有显著变化。结果表明,家蚕BmN细胞周期蛋白家族基因的表达水平受BmNPV DNA复制的影响,在不同感染时期,对BmN细胞周期蛋白家族不同基因抑制的效果不同。同时在本研究中采用冷冻真空结合辐射灭菌的方法制备的蛹虫草水提取液,对BmN细胞具有很好的抑制作用,浓度越高对BmN的抑制效果越明显,同一浓度作用时间越长抑制作用也越显著。在此基础上进一步阐明家蚕BmN细胞受到虫草水提取液抑制后,Cyclin家族基因的表达变化。在添加1 mg/mL的蛹虫草水提取液后24 h, CyclinA、B、B3、L1基因转录表达量即下降,其中CyclinB3基因表达量下降明显,为对照的35.14%,48 h各基因都下降至对照区的10%左右,72 h以后转录表达量变化不存在显著的差异。另外,CyclinE基因在诱导后24 h的转录表达量存在一个上升的过程,是对照的2.43倍,推测是由于在0~24h,蛹虫草水提取液使BmN细胞进行核内有丝分裂,从而导致CyclinE基因在这个时期表达量上升,而其他基因的表达量下降。……   
[关键词]:家蚕细胞周期蛋白家族基因;表达特点;功能分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:苏州大学2011年