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慢病毒携带bFGF基因对兔颈内动脉瘤壁的修复及机制研究

焦磊

  背景颅内动脉瘤是自发性蛛网膜下腔出血最主要的原因,占颅内出血的25%,致死率和致残率都很高。手术夹闭动脉瘤是目前临床治疗动脉瘤的主要方法,血管介入治疗动脉瘤技术在最近十几年也发展迅速,但后循环动脉瘤等接近生命中枢位置的动脉瘤在手术上依然存在着较大风险,某些复杂动脉瘤既手术困难同时也不能作介入治疗,故寻找一种保守疗法阻止或延缓动脉瘤破裂具有重要意义。 近些年来关于血管壁细胞的炎症、细胞外基质酶系参与动脉瘤形成过程的研究越来越深入。动脉瘤的形成可能正是由于在动脉分叉部位血流切应力的增加引起相应内皮细胞的结构与功能的变化,导致一些局部因子释放,进而使动脉壁发生生物学改变,其中包括内皮细胞受损变性及缺失,中膜平滑肌细胞萎缩凋亡等,最终导致动脉瘤形成。 尽管动脉瘤的形成、生长与破裂是一个连续的过程,但我们可以将其分为两个时期:动脉瘤形成期与动脉瘤生长破裂期。血流切应力是前者的力学因素,血管生物学机制的研究核心是管壁细胞,重点阐述内皮细胞通过什么机制来影响中膜平滑肌细胞及胞外基质尤其是基底膜与内弹力膜,因为只有它们的受损才能导致动脉瘤的形成。后者的力学因素则是血压相关应力,血管生物学机制研究重点是在内皮细胞受损情况下,中膜平滑肌细胞和Ш型胶原蛋白为主的胞外基质的变化及其变化原因。 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGF)是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用、调节细胞生长的肽类分子。FGFs家族成员是一种具有广泛生物学效应的生物因子,在促进胚胎发育、变异细胞生长、组织形成与修复、炎症、血栓形成、肿瘤发生与转移等生理及病理过程中起重要作用。对成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞有促增殖和分裂作用。FGFs能促进血管形成和促进成纤维细胞增殖的功能。体外碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的生物学活性除能引起细胞的增殖反应外,还包括能调节细胞的能动性、细胞分化、神经组织生长和再生中轴突的延伸和成活、动脉粥样硬化的斑块形成、肿瘤的发生、发展和转移等有关。 2004年Hoshina等人通过bFGF基因作用实验腹主动脉瘤的瘤壁发现bFGF能促进瘤壁平滑肌细胞增殖具有修复作用; 2007年Shiraya等人研究发现阿活他汀能抑制实验性腹主动脉瘤的扩大。因此本文我们拟用携带bFGF基因的慢病毒载体干预实验动脉瘤,观察其能否对动脉瘤起修复作用,为用保守疗法阻止或延缓动脉瘤的破裂提供理论依据。 第一部分兔颈内动脉瘤模型的建立及瘤壁血管平滑肌细胞表型探讨 目的研究弹性蛋白酶(elastase)诱导新西兰兔颈内动脉瘤壁平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型和骨架蛋白表达的动态变化。 方法通过弹性蛋白酶诱导兔颈内动脉,建立兔颈内动脉瘤模型,分别于第1、2、3、4周取下实验动脉瘤标本行HE染色,RT-PCR检测瘤壁平滑肌细胞表型基因SM22αmRNA表达,免疫荧光观察瘤壁SMα-actin、β-Tubulin和Desmin骨架蛋白的表达。 结果实验动脉瘤随着不断生长瘤壁逐渐变薄,弹性纤维断裂,平滑肌细胞减少, SM22α表达减少,SMα-actin、β-Tubulin和Desmin骨架蛋白的表达减少,第4周未检测到其表达。 结论动脉瘤的动态生长与VSMC表型由收缩型向合成型转化和骨架蛋白表达下调有关,其因果关系有待进一步研究。 第二部分碱性成纤维细胞生长因子对体外培养血管平滑肌细胞的作用 目的研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及初步作用机制。 方法用bFGF、bFGF+R1-分别作用体外培养的血管平滑肌细胞,用5-BrDU标记VSMC的增殖、RT-PCR检测VSMC表型标记基因SM22α和增殖负性调控基因HRG-1的表达。 结果bFGF分别作用血清培养的血管平滑肌细胞后,SM22α和HRG-1表达下调,5-BrDU标记的阳性增殖细胞增多;bFGF与R1-共作用时,SM22α和HRG-1的表达明显上调。结果表明bFGF对血管平滑肌的有促增殖和表型转化作用。 结论bFGF对血管平滑肌有促表型转化和增殖作用。其作用机制是通过R1受体来实现的。 第三部分携带碱性成纤维细胞生长因子慢病毒载体的建立及表达验证 目的应用分子生物学技术构建稳定表达bFGF的慢病毒。 方法设计bFGF基因的PCR引物,以pCI-bFGF质粒为模版,使用Taq酶进行bFGF的扩增。将pGC-FU慢病毒表达载体酶切,形成线性化载体,PCR扩增bFGF的基因片段与其交换反应。利用病毒包装细胞293T对慢病毒载体进行包装和构建。荧光、Real-time Q-PCR判定慢病毒滴度。 结果重组慢病毒质粒的鉴定均完全正确。病毒滴度1.0×108TU/ml。 结论结果表明携带bFGF的慢病毒包装成功,该病毒能稳定表达bFGF。它可能成为一种新的修复动脉瘤壁的方法。 第四部分慢病毒携带碱性成纤维细胞生长因子基因对兔动脉瘤壁的修复研究 目的通过注射携带bFGF的重组慢病毒(lentivirus)至动脉瘤模型来观察bFGF对颈内动脉瘤壁的修复作用。 方法建模后每天从兔耳缘静脉注射携带bFGF的慢病毒滴液,每隔1周处死1组兔并收集标本,RT-PCR检测瘤壁平滑肌细胞表型基因SM22αmRNA、HRG-1 mRNA表达,免疫组织化学染色观察瘤壁PDGF的表达。 结果慢病毒滴液干预的动脉瘤比对照组体积小,弹性纤维断裂程度减轻,平滑肌细胞数目较多, SM22αmRNA、HRG-1mRNA表达呈下降趋势。 结论携带bFGF的重组慢病毒能修复动脉瘤壁细胞的破坏,有抑制动脉瘤动态生长的作用。为今后保守治疗颅内动脉瘤提供了实验依据。……