手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

复方植物提取物对嗜水气单胞菌抑菌作用的研究

卢春霞

  嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是引起淡水鱼疾病最常见的一种致病菌,给淡水养殖业造成了重大的经济损失。目前,由嗜水气单胞菌引起的水产动物的疾病防治多采用抗生素,但是,抗生素的滥用造成了耐药性的增强,不仅给鱼病的治疗带来困难,对环境和人体也造成一定的危害。而植物提取物具有天然、无残留、毒副作用小、不产生耐药性等优点,可以解决抗药性和药物残留问题而倍受瞩目。本文通过抑菌实验筛选出一种抑制嗜水气单胞菌的复方植物提取物,并对复方中的原料进行了有效成分提取和分离纯化,以提高有效成分含量及抑菌活性;同时研究了复方提取物对嗜水气单胞菌抑菌机制,及对异育银鲫感染此菌后抗病能力的影响,为复方的开发和利用提供依据。 1、以最小抑菌浓度(MIC)为检测指标,研究16种植物提取物对嗜水气单胞菌的抑菌作用,筛选出5种抑菌活性较强的植物提取物,分别是茶多酚和五倍子、大黄、黄芩、诃子提取物,MIC分别为0.195-0.390 mg/mL、0.097-0.195 mg/mL、0.78-1.560 mg/mL、1.560-3.125 mg/mL和1.560-3.125 mg/mL。采用此五种植物提取物,利用正交t值法进行复合组方配比,确定最佳复方的剂量配比为,茶多酚:五倍子提取物:大黄提取物=5: 2: 1(w/w/w),此复方对嗜水气单胞菌的MIC为0.078 mg/mL。 2、为了提高复方的抑菌活性,对复方进行优化。首先采用离子液体-超声微波协同提取(IL-UMAE)技术对上述复方中原料的提取工艺进行优化,以最大化提取有效成分。得出五倍子鞣质最佳提取条件为:2.5 mol/L的[bmim]Br为萃取剂,料液比为1:15(g/mL),微波功率为400 W,提取时间为1 min;大黄蒽醌最佳提取条件为:[bmim]Br浓度为2.0 mol/L,微波功率为500 W,料液比为1:15(g/mL),提取时间为2 min。与常规提取方法比较,提高了提取效率,缩短了提取时间。利用优化的方法对不同来源的五倍子和大黄进行提取,并对有效成分进行分析,目的是选择有效成分含量高的原料。分析结果显示,不同来源的原料有效成分含量差异较大,其中以湖北的肚倍鞣质含量最高,甘肃的掌叶大黄蒽醌含量最高,因此,在原料选用时选择此产地的两种原料。由于茶多酚已商品化且价格便宜,因此复方中的茶多酚选用购买,含量和主要成分采用行标(QB 2154-1995)和HPLC来分析。结果表明,茶多酚纯度为85.43%;HPLC分析显示,五种儿茶素含量51.42%,占茶多酚总量的60.20%。 3、原料(湖北肚倍和甘肃掌叶大黄)在优化条件下提取后,通过大孔树脂对有效成分进行富集,以提高其纯度。通过静态吸附实验,选择出适合分离五倍子鞣质和大黄蒽醌的中等极性树脂XDA-6和非极性树脂HPD-100,吸附温度为28°C。然后通过动态吸附和解吸实验,确定两者的最佳分离纯化条件为:径高比为1:8,上样体积为2BV,流速1.0 BV/h,85%的乙醇洗脱,洗脱体积分别为2BV和3BV。在最佳条件下,XDA-6对五倍子鞣质的动态吸附率为94.78%,洗脱率91.62%,鞣质含量由原来的70.24%提高到85.12%,总回收率99.06%;HPD-100对大黄蒽醌的动态吸附率为86.34%,洗脱率85.92%,五种蒽醌含量由原来的7.13%增加到20.52%,总回收率98.73%。通过UPLC-MS/MS技术分析,提取物中残留的离子液体[bmim]Br也同时被除去。 茶多酚与纯化后的五倍子和大黄提取物按着5: 2: 1的比例再次配比,对嗜水气单胞菌的MIC为0.060 mg/mL,与优化前的复方相比(0.078 mg/mL),提高了其抑菌活性。并建立了一种同时测定复方中10种主要有效成分的UPLC-MS/MS分析方法。色谱条件:Acquity UPLCTM BEH C18柱;柱温:45°C;流动相:乙腈(A);0.1%乙酸(B);梯度洗脱程序:20 min内流动相由5A/95B变成100A/0B;流速0.3 mL/min;DAD为检测器;扫描范围为200-500 nm;进样量为0.5μL。离子源:电喷雾电离(ESI-),毛细管电压:3.0 kV,锥孔电压:20 V,离子源温度:100°C,脱溶剂气温度:400°C,碰撞能量:6 eV ,反溶剂气流:500 L/h,质量范围: 50-1500 m/z。10种成分在0.70-120μg/mL范围内呈线性关系,10种成分检测限范围为0.009-0.084μg/mL,有较好的精密度和稳定性。采用新建立的方法检测优化后复方的有效成分,10种成分在复方中的质量百分比为:没食子酸5.27%,表没食子儿茶素(EGC)3.30%,儿茶素1.08%,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)19.32%,表儿茶素没食子酸酯(ECG)5.46%,芦荟大黄素0.23%,大黄酸0.56%,大黄素1.28%,大黄酚0.75%,大黄素甲醚0.39%。 4、为给优化后的复方抗菌剂的进一步应用提供理论支持,本实验研究了复方对嗜水气单胞菌的膜作用机制。结果显示,嗜水气单胞菌经复方提取物处理后,细胞膜电位改变,内外膜的通透性增加,引起钾离子泄漏;同时流式细胞仪分析显示,嗜水气单胞菌经过复方作用后,PI阳性染色率达到了42.48%,表明细胞膜的完整性遭到破坏;进而透射电镜观察,细菌超微结构遭到破坏,形态发生改变,造成细胞内容物外泄,从而造成细菌死亡。 5、选择240尾鲫鱼作为研究对象,研究优化后的复方对鱼类细菌性疾病的应用防治效果。分别在基础日粮中添加质量浓度为0%(对照)、0.5%、1.0%、2.0%的复方植物提取物,饲养8周后,测其生长、免疫、抗氧化等指标,并注射嗜水气单胞菌进行攻毒实验。结果显示,与对照组比较,1.0%和2.0%的添加组特定生长率显著提高了22.06%和33.82%(P < 0.05),饵料系数也显著降低了17.11%和26.64%(P < 0.05)。免疫指标测定结果表明,中、高剂量(1.0%、2.0%)添加组的血清总蛋白含量、溶菌酶和酸、碱磷酸酶活性均明显提高(P < 0.05)。抗氧化指标测定结果显示,植物提取物显著(P < 0.05)提高了实验鲫鱼肝脏中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性,降低了羟自由基和丙二醛水平,提高了机体抗氧化能力。攻毒实验数据表明,异育银鲫感染嗜水气单胞菌后,死亡率从对照组的100%分别显著下降到57.69%(1.0%添加组)和46.15%(2.0%添加组)(P < 0.05)。以上结果表明,1.0%和2.0%的复方植物提取物可以提高机体的免疫功能和抗氧化能力,显著减低了异育银鲫感染嗜水气单胞菌后的死亡率。……   
[关键词]:植物提取物;嗜水气单胞菌;离子液体;超声微波辅助提取;大孔树脂;HPLC;UPLC-MS/MS;抑菌机制;异育银鲫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2011年