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L-缬氨酸高产菌株的选育及其特性的初步研究

刘焕民

  L-缬氨酸不仅是支链氨基酸,而且是人体八种必需氨基酸之一,在生命体各种重要的生理活动中起着不可替代的作用。L-缬氨酸应用领域非常广阔,在医药、食品强化剂、饲料添加剂、调味品和农药等方面都有重要的应用。现阶段国内的L-缬氨酸发酵水平不高,全国年产量远远不能满足国内市场日益增长的需求。为了解决上述问题,本课题依据代谢工程原理,选育可以高效生产L-缬氨酸的菌种,具体结果如下: ⑴用硫酸二乙酯(DES)和亚硝胍(NTG)处理出发菌株黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) ZGH6128,经过筛选最终获得菌株NVT1103(Leu~l,α-AB~(hr), 2-TA~(hr),SG~r)与菌株JVHK597(Leu~-,Ile~-,Met~l,α-AB~r,2-TA~r)。在未优化的条件下,两株菌的摇瓶产酸量分别为37.6g/L和41.2g/L。 ⑵利用原生质融合技术进行氨基酸菌种选育的研究引起国内外技术人员的关注,本课题以菌株NV1103和JVHK597为亲本菌株,采用原生质体融合方法进行选育L-缬氨酸高产菌株。用0.5U/mL与1U/mL的青霉素钠盐溶液分别预处理双亲本菌株(NV1103与JVHK597)2.5h和3h;溶菌酶处理亲本株的最适浓度为1g/L与2g/L,分别处理9h和11h;再生培养基中渗透压稳定剂浓度为0.6mol/L;在34°C、pH10的缓冲体系中,400g/L的PEG介导25min,可以获得理想的融合率。最终选育出高产菌株NJv61,遗传标记为(Leu~-,Ile~-,Met~l, 2-TA~(hr), SG~r, Glc~(hr),α-AB~(hr)),未优化条件下,摇瓶产酸量为45.6g/L。 ⑶利用正交表进行实验设计确定菌株NJv61种子培养基的组成:葡萄糖24g/L,玉米浆35g/L,(NH_4)_2SO_4 5g/L,KH_2PO_4 0.6g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5g/L,CaCO_3 10g/L。对菌株发酵过程中所需的碳(氮)源、无机盐、生长因子等进行了单因素实验,在此基础上通过响应面方法确定了该菌株发酵培养基的最佳组成:葡萄糖149g/L,玉米浆19.4g/L,(NH_4)_2SO_4 48.4g/L,KH_2PO_4 1.5g/L,MgSO_4·7H_2O 0.6g/L,VB1 150μg/L,VH 60μg/L。在7L发酵罐中,优化条件下NJv61经过72h发酵,在发酵液中积累L-缬氨酸达到51.8g/L。 ⑷对L-缬氨酸产生菌筛选过程中所获得的代表菌株(ZGH6128、NVT1103、JVHK597和NJv61),在7L发酵罐产酸过程的中后期进行取样分析,明确了该时期相关菌株细胞内与合成L-缬氨酸相关的代谢途径网络分布。与出发菌株ZGH6128相应途径上的流量相比,目的菌株NJv61在节点G6P处流向EMP途径的碳架流量有了显著的提高,同时,在HMP途径中仍然保持较大流量。在丙酮酸节点处,目的菌株流向TCA循环的代谢流量较出发菌株大大减少,使更多的碳架流进入L-缬氨酸合成途径。目的菌株中丙氨酸生物合成途径中的碳架流量较出发菌株没有明显的下降。 ⑸乙酰羟基酸合成酶(AHAS)是半理性化育种工作的靶酶,目的菌株NJv61对高浓度α-AB和2-TA具有抗性,研究发现该菌株的AHAS基因发生了突变,更彻底地解除L-缬氨酸反馈抑制与阻遏作用,并且酶的相对活性也有改变。本课题对AHAS基因进行了克隆,对测序的结果进行了比较分析发现,调节亚基所对应的基因区段,仅分布着整个基因突变位点总数大约10%的突变碱基,而编码催化亚基的基因区段布着的突变位点数约为整个基因所有突变位总数的90%。最后把菌株NJv61的AHAS基因与特定的表达载体相连接,导入模式菌株,经IPTG诱导,所表达的酶蛋白分子在4℃条件下不稳定,22h内该酶相对酶活迅速下降,仅保持大约20%相对活性。……   
[关键词]:L-缬氨酸;育种;诱变;原生质体融合;发酵;代谢流量分析;黄色短杆菌
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2011年