手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究

熊玲芳

  草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV) ,属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属,其基因组的特点是11条分段dsRNA的3′端不含poly(A)尾,且在5′和3′末端各含有特异的重复保守序列。GCRV的基因组编码12种蛋白,包含7种结构蛋白和5种非结构蛋白。其中VP6是一种结构蛋白,它由S8基因片段编码,在病毒的转录与复制及病毒核衣壳的形成中起重要作用。NS38是一种非结构蛋白,它由S9片段编码,在病毒早期形态发生阶段起重要作用。有研究表明VP6诱导中和抗体效价较高,NS38诱导的中和抗体效价次之,二者都能够诱导中和抗体的产生。本研究以草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)为研究对象,应用同源克隆获得GCRV096 vp6和ns38基因序列,并对其进行表达,同时对VP6和NS38蛋白的免疫原性进行研究。 vp6基因含有一个1236 bp的开放阅读框(ORF),编码412个氨基酸,预测VP6蛋白分子量约为44 kDa,等电点为8.5。与其它几种GCRV病毒分离株相比,核苷酸序列的同源性要高于其氨基酸序列的同源性。将vp6基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-vp6,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,纯化表达的目的蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体,得到兔抗GCRV096-VP6蛋白血清。通过ELISA检测,兔抗GCRV096-VP6蛋白血清的效价为1:32000。将制备的抗血清与CIK细胞孵育48 h,然后对CIK细胞进行病毒感染,应用定量PCR对CIK细胞中GCRV096 vp6基因的表达进行定量,进而分析VP6蛋白的免疫原性,实验结果表明实验组的GCRV病毒含量明显少于对照组,说明VP6蛋白具有较强的免疫原性。 ns38基因含有1059 bp的ORF,编码352个氨基酸,预测NS38蛋白分子量约为37.7 kDa,等电点为7.5。与其它几种GCRV病毒分离株相比,核苷酸序列的同源性要高于其氨基酸序列的同源性。将ns38基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-ns38,再导入到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,进而纯化表达的目的蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体,得到兔抗GCRV096-NS38蛋白血清。通过ELISA检测,兔抗GCRV096-NS38蛋白血清的效价为1:38400。将制备的抗血清与CIK细胞孵育48 h,然后对CIK细胞进行病毒感染,应用定量PCR对CIK细胞中GCRV096 ns38基因的表达进行定量,进而分析NS38蛋白的免疫原性;实验结果表明实验组的GCRV病毒含量明显少于对照组,说明NS38蛋白具有较强的免疫原性,而且在感染GCRV病毒4 h时,实验组病毒的含量与对照组之比最小,表明此时NS38蛋白发挥免疫原作用较强。 本论文研究了GCRV096 vp6和ns38基因和VP6和NS38蛋白特性,并对VP6和NS38蛋白的免疫原性进行了研究,为草鱼出血病的防治等研究提供了理论依据并奠定了基础。……   
[关键词]:GCRV096;vp6;ns38;克隆;原核表达;免疫原性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广东海洋大学2011年