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河南部分地区猪等孢球虫流行情况调查、致病试验与药物防治

宁长申

  猪球虫病是猪常见多发的寄生性原虫病,呈世界性分布,在集约化和散养的猪群中广泛传播流行。该病对于幼龄猪,主要表现为腹泻、食欲减退和体重下降等临床症状,严重者可导致死亡。成年猪则多为带虫宿主,不表现临床症状,但多为本病的传染源。猪球虫病严重制约着养猪业的发展,可给养猪造成较大的经济损失,据报道,欧美等国家每年用于该病的预防和治疗费用高达1亿美元以上。但由于球虫具有严格的宿主特异性,试验研究只能以猪作为模型动物,其自身特点及试验管理的难度相对较大,加之猪球虫的繁殖率较低和哺乳动物球虫人工感染试验研究的不确定性,导致对猪球虫的研究相对较少。本论文就猪等孢球虫的生物学特性以及分子种系发育关系等方面进行了研究。 1、为了解河南省猪球虫感染情况和虫种分布,于2005年5月至2008年8月,先后应用饱和盐水漂浮法对河南省商丘、洛阳、漯河、鹤壁、郑州等17个县市24个规模化养猪场和12个养猪专业户的猪球虫感染和虫种分布情况进行了调查,结果在34个场、户中均发现有球虫感染,猪球虫总场阳性率高达94.44%,猪等孢球虫为83.33%,艾美尔球虫为80.56%;规模化猪场猪等孢球虫场阳性率高达91.67%,显著高于养猪专业户的场阳性率(66.67%);规模化猪场艾美尔球虫场阳性率为79.17%,低于养猪专业户的场阳性率(83.33%)。共检测粪便样品2388份,球虫总阳性率为13.11%,规模化猪场与专业户猪的球虫阳性率分别为12.83%和14.00%;猪等孢球虫和艾美尔球虫的总阳性率(分别为7.96%和5.15%)无明显差异,但规模化猪场的猪等孢球虫阳性率(8.90%)显著高于养猪专业户的猪(4.85%),而艾美尔球虫的阳性率则相反,分别为3.93%和9.16%。不同规模猪场各年龄段猪球虫感染率存在显著差异。规模化猪场不同年龄段猪球虫感染率和不同规模场猪球虫感染率在20-30日龄之前逐渐升高和其后呈逐渐降低的趋势,但在养猪专业户中,11-20d猪的球虫感染率最高,为25.71%,21-30d时感染率最低,为3.67%,其后的31-40d感染率又突然升高达18.12%。规模猪场和养猪专业户的猪等孢球虫感染率、不同规模猪场的猪等孢球虫平均感染率均以11-20日龄仔猪最高,分别为16.43%、20%和17.13%,且此前感染率逐渐升高和此后感染率显著降低;190例猪等孢球虫阳性猪亦以11-20日龄段感染率最高,其中规模猪场仔猪为28.83%而在养猪专业户仔猪为51.85%,未见养猪专业户中41日龄以上仔猪感染猪等孢球虫。猪等孢球虫阳性的规模化猪场感染率变化在1.25%-50%,专业户猪场感染率变化在1.79%-15.28%。随着猪年龄的增长,不同规模猪场的猪艾美尔球虫平均感染率呈现增高趋势,以41日龄以上的猪感染率最高,为7.48%。养猪专业户的31-40日龄和40日龄以上的猪艾美尔球虫感染率分别为15.22%和12.17%,显著高于30日龄以下仔猪和规模猪场各年龄段的猪;规模猪场以21-30日龄和41日龄以上猪的艾美尔球虫感染率较高,分别为5.50%和5.86%。但不同场猪艾美尔球虫感染率存在显著差异,最高者达60%。不同规模猪场不同年龄段的猪艾美尔球虫感染率存在显著差异,各规模猪场各年龄段猪艾美尔球虫感染情况变化在0.84%-19.15%,各养猪户各年龄段猪艾美尔球虫感染情况变化在2.78%-23.26%。123例艾美尔球虫阳性猪亦以规模猪场41日龄以上猪感染率最高,为44.44%;其次为21-30日龄仔猪,感染率为23.61%。专业户所养的猪以41日龄以上和31-40日龄仔猪感染率最高,分别为45.10%和41.18%。共发现2属8种球虫,分别为猪等孢球虫(Isospora suis)、猪艾美尔球虫(Eimeria suis)、豚艾美尔球虫(E. porci)、新蒂氏艾美尔球虫(E. neodebliecki)、蒂氏艾美尔球虫(E. debliecki)、极细艾美尔球虫(E. perminuta)、粗糙艾美尔球虫(E. scabra)和杨陵艾美尔球虫新种(Eimeria yanglingensis sp.);球虫OPG值均不大,规模猪场猪球虫平均OPG值为9313(200-46400),猪等孢球虫平均OPG值为7827(200-46400);养猪专业户猪球虫平均OPG值为10818(800-24600),猪等孢球虫平均OPG值为8300(2400-22600);各球虫阳性猪场各年龄段仔猪均存在4-6种球虫混合感染,其中I.suis见于各年龄段仔猪,属优势虫种。 2、为了解猪等孢球虫生物学特性,采用单卵囊分离技术分离纯种猪等孢球虫卵囊,分别给6头3日龄仔猪一次经口感染30个孢子化猪等孢球虫卵囊。经形态学鉴定,传代卵囊为纯种猪等孢球虫卵囊,收集其卵囊进行继代扩增,分别经口灌服感染6头3日龄和22头5日龄无球虫仔猪,每头感染2000个孢子化卵囊,获得大量纯种猪等孢球虫卵囊。结果表明,卵囊形态与其排出时间存在一定关系,不同温度对其卵囊孢子化存在影响;薄壁型和厚壁型卵囊在孢子化过程中存在较大差异。 3、为了解仔猪感染猪等孢球虫后的排卵囊规律,分别设置10个不同接种剂量感染组(30,0.2×104,1×104,5×104,15×104,20x104,22x104,30×104,50×104,100×104),于3日龄一次经口感染无球虫仔猪,每头接种卵囊液为2mL。结果发现,除感染30个卵囊剂量组潜隐期为9d外,其他不同剂量组潜隐期4-6d,多为5d;不同组别显露期存在较大差异,最短为4d,最长为15d,多数为5d-9d;排卵囊高峰集中出现在感染后第7d-11d。第二次排卵囊高峰出现在第一次结束后1-2d,持续4-6d,排卵囊量明显小于第一个高峰期。试验表明,仔猪感染猪等孢球虫后,其潜隐期、显露期和感染强度与感染剂量存在相关性,感染剂量越大,潜隐期和显露期越短,OPG值也越大;感染剂量越小,潜隐期和显露期越长,OPG值越小。 4、应用纯种猪等孢球虫(Isospora suis)孢子化卵囊人工感染9头6日龄仔猪,利用Sysmex sf-3000全血细胞分析仪和日立7060型全自动生化分析仪分别检测了感染前1d和感染后1,3,6,9,11d时血液生理生化指标。结果表明:仔猪感染I. suis后,白细胞数在感染后1d开始增多,11d达最高;红细胞在感染后3d开始减少,9d最低,11d时恢复到感染前水平。血清丙氨酸氨基转移酶活性逐渐升高,感染后11d时达最高值;天冬氨酸转氨酶感染后6d升高并达到最高;感染后1d碱性磷酸酶活性下降,11 d最低;血清乳酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶、α-羟丁酸脱氢酶活性均呈下降趋势,但无显著差异。感染后1d时白蛋白含量下降,至11d恢复到正常水平;球蛋白含量持续下降,但差异不显著。血清葡萄糖含量升高但无显著变化。感染后1-3d时血清尿素氮含量降低,之后逐渐升高,至11d时达最高;尿酸在感染后1-3d升高,之后持续下降,至11 d时最低。血清总胆固醇持续降低;甘油三酯在感染后1-9 d升高,11d时恢复到感染前水平。血清K+含量在感染后持续降低,但差异不显著。嗜中性白细胞、单核细胞、血红蛋白含量、红细胞压积、总蛋白含量、Na+、Cl-、Ga2+、Mg2+含量均无明显变化。 5、为了研究仔猪感染猪等孢球虫后T细胞亚群的变化规律,应用纯种猪等孢球虫孢子化卵囊人工感染9头6日龄仔猪,分别检测了感染前和感染后1、3、6、9、11d(DPI)外周血中CD3+、CD4+、CD8+T细胞。结果显示,DPI 3,CD3+、CD4+T细胞增加,之后下降,但差异均不显著(P>0.05);CD8+T细胞在DPI 6增加,DPI 9达峰值(P<0.05)。CD4+/CD8+值在DPI 6下降,DPI 11达到最低点。表明DPI 3感染仔猪的免疫功能有所增强,DPI 8后仔猪免疫功能受到抑制。 6、为了解猪等孢球虫的内生发育及其对仔猪的致病性,45头无球虫仔猪分为5.0×104、1.0×105、1.0×104、5.0×104、1.0×105、1.5×105、2.0×105、5.0×105、1.0×106个·头-1孢子化猪等孢球虫卵囊9个剂量感染组,于仔猪3日龄时一次经口感染,另设2个不感染空白对照组,每组5头仔猪。结果显示,猪等孢球虫以内芽生增殖形成双核的Ⅰ型裂殖体及裂殖子和多核的Ⅱ型裂殖体及裂殖子;虫体主要寄生于空肠中、后段和回肠的黏膜上皮细胞带虫空泡内,偶见于肠隐窝内;未见大配子体的嗜曙红造壁体;产生薄壁型和厚壁型2种卵囊;薄壁型卵囊壁常在孢子化过程中皱缩或皱裂。接种不同剂量卵囊的仔猪,其临床症状表现不同但均出现腹泻症状。随感染剂量加大,临床症状加重,粪便记分值增大,死亡率升高,大剂量感染仔猪增重率显著降低;低剂量感染仔猪显露期出现在腹泻之后,高剂量感染显露期与腹泻几乎同时出现。表明猪等孢球虫对仔猪具有较强的致病性。 7、从Genbank数据库中下载5条已发布的等孢球虫18S rRNA基因序列(I. suisISU97523、Ⅰ. beill DQ060658、Ⅰ. ohioensis AF029303、Ⅰ. felis L76471、Ⅰ. robiniAF080612),用OMIGA2.0软件比对,生成一条一致性序列,再用软件Primer premier5.0设计一套套式-PCR引物,并对退火温度、Mg2+浓度、dNTP量、模板量、引物浓度等进行了优化。特异性试验结果显示,所设计的引物可以从猪等孢球虫及艾美尔球虫中扩增得到明亮的目的条带,亦可扩增出弓形虫但不能扩增隐孢子虫,而均不能从常见的肠道细菌(Escherichia coli, Clostridieum welchii, Chain coccus)中扩增出任何目的条带。敏感性试验结果显示,引物可从相当于0.5个卵囊的DNA样品中扩增出明亮条带。模拟田间试验表明,所设计的PCR方法对粪便中等孢球虫的检出率明显高于MacMaster s法;而且反应体系可以从大约含135个卵囊的粪样中提取并扩增出目的基因条带。利用所建立的PCR方法体系,并借助MEGA4.0软件对河南省4个地区的猪等孢球虫分离株以及一个传代株进行了种系发育关系研究,结果显示,河南省猪等孢球虫分离株之间没有序列差异,同源性为100%;进化树上5个分离株处于单一进化分支。本试验所建立的套式-PCR方法可用于猪等孢球虫的分子流行病学和种系发育关系研究。 8、为评价百球清对仔猪等孢球虫病的治疗效果,对自然感染猪等孢球虫的7日龄仔猪,分别以15mg·头·次-1、12.5mg·头·次-1剂量4次灌服百球清。结果,其平均抗球虫指数(ACI)分别为1.387和1.322,粪便检查分别在给药后第2d、第3d卵囊转阴,治愈率达100%,表明百球清对仔猪等孢球虫病具有良好的治疗效果。 9、为评价百球清对仔猪等孢球虫病的预防和治疗效果,对有猪等孢球虫病史猪场的3日龄仔猪和临床发病的仔猪群,以20-25mg-kg-1剂量1次灌服百球清,结果:药物预防仔猪均未感染球虫且增重效果明显。患病仔猪在用药后第3-4d症状消失,卵囊转阴率均为100%,增重率提高11.63%-13.99%,ACI在1.357-1.380,表明对临床仔猪等孢球虫病具有良好治疗效果。根据猪等孢球虫病流行特点并结合本课题研究成果,制定了“饲养管理科学化、兽医卫生制度化、驱虫防疫规范化”的仔猪等孢球虫病综合防治措施,并在河南省的郑州、洛阳、开封3市部分规模化猪场进行了实施,结果表明,仔猪猪等孢球虫感染率由方案实施前的30.84%下降到5.09%-8.80%,OPG值显著降低,实施场未发生因等孢球虫病引起的仔猪死亡,较好地控制了仔猪猪等孢球虫病的发生和流行,取得了显著的经济效益和社会效益,有力地促进了河南养猪业的发展。……   
[关键词]:;等孢球虫;流行;18S rRNA;种系发育分析;河南
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年