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基于REMAP和IRAP分子标记的梅(Prunus mume Sieb. et Zucc.)遗传多样性分析

沈玉英

  梅(Prunus mume Sieb. et Zucc.)原产中国,是我国著名观赏和加工保健食用的特产树种。其栽培历史悠久,种质资源丰富。逆转座子通过RNA为中介进行转座,在植物基因组中分布广,拷贝数多,异质高,在种内和种间表现出较高的序列差异性和丰富的插入多态性,引起稳定突变,基于这些特点开发出的几种分子标记与常规分子标记比较,显示出基因组覆盖面广、多态性丰富的优点。本研究通过表型数量性状分类与DNA分子标记的梅遗传多样性特征分析,探讨梅种质资源的遗传多样性和亲缘关系,为今后有效开展种质资源的开发及创新利用提供理论依据。主要研究结果如下: 1.基于重要表型性状数量分类的梅遗传多样性分析 以南京农业大学国家梅种质资源圃保存的84个梅品种为试材,运用SPSS 11.5对叶花果等31个重要表型性状进行Q聚类和主成分及因子分析,84个梅品种分为5组,其中‘长农17’等13个果梅品种为第一组;‘红梅’等30个果梅品种为第二组;‘重叶梅’等15个花梅品种为第三组;‘银红朱砂’等9个花梅品种为第四组;‘小绿萼’等17个花梅品种为第五组。果梅品种与花梅品种分别聚类。果梅中的‘透骨红’介于花梅和果梅之间。31个表型性状中果实光亮度、果实黄蓝偏差、果实横径、单果重、果实侧径、单核重、花瓣数、花瓣层数、a果、果实纵径共10个性状在梅品种数量分类中起重要作用。2.基于REMAP标记技术的梅遗传多样性分析 通过DNA纯化方法、5因素4水平L16(45)的完全随机正交试验、不同浓度PAGE胶、引物3’的碱基等的研究,建立了适合梅REMAP标记的技术体系。体系总体积25μl:基因组DNA40 ng、2.5 mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL、10×Buffer 2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5 U、10μmol/LLTR引物1.0μL、10μmol/L SSR引物1.0 gL,加ddH2O至25μL。以一次裂解,抽提后加RNase获取的DNA质量好;REMAP体系的SSR引物的3’端加碱基明显提高REMAP的扩增效果,但碱基数量无明显影响。浓度为5%的PAGE胶电泳条带数量多、清晰地反映品种间的多态性,且制胶方便,不易碎胶。 筛选出5对LTR-SSR引物组合,用于84个梅品种的REMAP遗传多样性分析,共产生122个多态性位点。5对引物组合的香浓信息指数I在0.3897-0.6364之间,Nei s遗传多样性指数He在0.2395-0.4455之间;对REMAP扩增结果进行UPGMA聚类,在相似系数0.766处,84个梅品种可分为18组,果梅与花梅分别聚类;‘小叶猪肝’与‘大叶猪肝’呈现出明显的多态性,‘小叶猪肝’在198 bp和600 bp出现多态性位点。用PopGen32分析梅遗传多样性,推测日本果梅可能引自中国浙江,日本花梅引自中国江苏;花瓣3层是梅花瓣数量引起遗传变异的起点,3-5层间遗传基本稳定,果梅花瓣1层、花梅花瓣5层具有较明显的遗传多样性。品种间的遗传距离,84个梅品种中,最近的是‘双粉垂枝’与‘粉皮宫粉’为0.059,最远的是‘云南红梅’与‘大粒’为0.630;果梅品种中,最近的是‘黄小大’与‘福建白粉’为0.104,最远的是‘四月梅’与‘信侬小梅’为0.487;花梅品种中,最近的是‘双粉垂枝’与‘粉皮宫粉’为0.059,最远的是‘中玉宫粉’与‘云南丰后’为0.556。基因流强度的群体每代迁移数梅品种群最大。3.基于IRAP标记技术的梅遗传多样性分析 通过5因素4水平L16(45)的完全随机正交试验、不同浓度PAGE胶等的研究,建立了适合梅IRAP标记的技术体系。体系总体积25μ1:基因组DNA30ng,2.5 mmol/L MgCl2 2.0μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5μL,10×Buffer 2.5μL, Taq DNA聚合酶1.0 U,10μmol/L LTR引物1.0μL,加ddH20至25μL。6%和8%浓度的非变性PAGE胶适于IRAP多态性检测。 筛选出6条LTR引物,用于84个梅品种的IRAP遗传多样性分析,共产生99个多态性位点。6条引物的香浓信息指数I在0.3359-0.5807,Nei s遗传多样性指数He在0.1967-0.3976之间;对IRAP扩增结果进行UPGMA聚类,在相似系数0.766处,84个梅品种聚为41组,果梅的‘长农17’与花梅宫粉型的‘粉皮宫粉’、‘香雪宫粉’、‘云南红梅’、‘小玉宫粉’聚一起,花梅的‘美人梅’与果梅的‘信侬小梅’聚一起,其余都是果梅与花梅分别聚类。日本果梅品种的‘玉英’、‘白加贺’、‘月世界’、‘古城’、‘节田梅’、‘花香实’聚在一起。‘大叶猪肝’与‘小叶猪肝’不聚在一组。应用PopGen32分析了梅遗传多样性,日本、江苏、浙江品种群亲缘关系最近,推测日本果梅引自中国浙江,日本花梅引自中国江苏;花瓣3层是梅花瓣数量变异引起遗传变异的起点,3-5层间遗传基本稳定。84个梅品种的遗传距离,最近的是‘白加贺’和‘月世界’为0.107,也是果梅中最近的,最远的是‘甲州小梅’和‘骨红垂枝’为0.683;果梅品种中最远的是‘东山李梅’和‘横核’为0.588;花梅品种中,最近的是‘香雪宫粉’和‘云南红梅’为0.118,最远的是‘云南丰后’与‘骨红垂枝’为0.663。 4.基于REMAP-IRAP分子标记的梅遗传多样性分析 综合REMAP和IRAP进行梅遗传多样性分析,梅群体的观测等位基因数1.9955,有效等位基因数为1.4887,Nei s遗传多样性为0.2910,Shannon信息指数为0.4465。UPGMA聚类,84个梅品种在相似系数0.766处被分为30组;在相似系数0.752处,被分成20组。果梅与花梅分别聚类,说明果梅与花梅间基因渗透较少。日本果梅亲缘关系较近的有‘白加贺’、‘月世界’与‘古城’;‘养老3号’与‘莺宿’;‘甲州最小’、‘玉英’与‘花香实’;青梅分组聚一起,但有部分红梅聚在青梅一起,白梅与青梅接近;‘大叶猪肝’与‘小叶猪肝’较远。花梅品种聚类中,朱砂型紧密在一组,垂枝型梅松散聚一组,玉碟型(除‘龙泉玉蝶’)在一组;春后、绿萼类型的品种群分散聚在一起,宫粉型分为3组,表明遗传背景复杂,进化程度不一。PopGen32分析,推测日本果梅品种群引自中国浙江,日本花梅品种群引自中国江苏。梅花瓣数3层为多层明显变化的层数,1、2层的遗传基因与3-5层有明显的不同,3-5层基本稳定。各品种间的遗传距离,梅品种中最近的是‘白加贺’与‘月世界’为0.136,最远的为‘丰后’与‘横核’为0.602;果梅品种中,最近的是‘白加贺’与‘月世界’为0.136,最远的是‘横核’与‘东山李梅’为0.464;花梅品种中,最近的是‘粉皮宫粉’与‘香雪宫粉’及‘银红朱砂’与‘南京红须’为0.141,最远的是‘骨红垂枝’与‘云南丰后’为0.508。……   
[关键词]:;表型性状;数量分类;REMAP;IRAP;遗传多样性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年