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视黄醇对脂多糖诱导的大鼠乳腺炎症反应的调节及机制研究

顾蓓蓓

  本实验选用健康SD大鼠,利用LPS诱发试验性大鼠乳腺炎模型,研究多功能营养素视黄醇对大鼠乳腺防御机能的影响和保护作用;并建立原代培养的大鼠乳腺上皮细胞炎症反应模型,进一步在体外研究了视黄醇对大鼠乳腺上皮细胞炎症反应的调节机制。 1视黄醇对试验性乳腺炎大鼠的保护作用研究 为研究视黄醇对LPS诱发的试验性乳腺炎大鼠的保护作用,40只清洁级SD孕鼠随机分为正常对照组(NC,n=8)、阳性对照组(PC,n=8)和试验组(T,n=24)。自怀孕第十天起,试验组分别灌胃视黄醇(溶解于大豆油)4000 I.U/kg·d(L, n=8)、8000 I.U/kg·d(M, n=8)、16000 I.U/kg·d (H, n=8),对照组灌胃等量的大豆油,连续灌胃十天。产后72 h分别灌注灭菌生理盐水和10μg/侧LPS到大鼠第四对乳腺(两侧)内,12 h处死大鼠,收集血清及乳腺组织样品。LPS灌注乳腺12 h后,乳腺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAGase)活性,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)均显著升高,血清中MPO、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、总抗氧化能力(total anti-oxidizing capability, T-AOC)及乳腺组织中白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)水平显著降低。与阳性对照组相比,灌胃视黄醇显著降低乳腺组织中MPO、NAGase的活性及TNF-α水平,显著提高血清中IL-2水平;低、中剂量视黄醇能降低中性粒细胞(neutrophil,PMN)在乳腺组织中的浸润,提高血清SOD活性及T-AOC,改善因LPS引起的外周血T淋巴细胞CD4+与CD8+比值的失衡。结果证实视黄醇对LPS诱发的试验性乳腺炎大鼠有一定的保护作用。 2视黄醇对试验性乳腺炎大鼠炎性细胞因子释放的影响 为探讨视黄醇对试验性乳腺炎大鼠炎性细胞因子释放的调节作用机制,72只清洁级SD怀孕大鼠被随机分成对照组(C,n=36)和试验组(T,n=36)。怀孕第十天起,每天灌胃视黄醇8000I.U/kg·d(溶解于大豆油),连续灌胃十天;对照组灌胃等体积的大豆油。产后72 h经乳头管灌注LPS 10μg/侧到第四对乳腺(两侧)内,分别于灌注前(定义为0 h)及灌注后2、4、8、16和24 h(n=6)颈静脉放血处死动物,采集样品。试验结果显示,视黄醇处理显著降低了LPS灌注后乳腺组织中Toll样受体-4(toll-like receptor-4, TLR-4)、核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB) p65 mRNA表达,显著抑制NF-κB与DNA的结合活性,显著降低乳腺组织中(?)(?)NF-α与白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的释放。结果表明,灌胃视黄醇通过降低TLR-4 mRNA的表达,抑制NF-κB p65 mRNA表达及NF-κB与DNA的结合活性,抑制其下游相关炎症因子TNF-α及IL-1β的过度释放,减轻炎症因子对乳腺组织的损伤。 3视黄醇对试验性乳腺炎大鼠中性粒细胞活性的影响 为探讨视黄醇对试验性乳腺炎大鼠中性粒细胞活性的影响,72只清洁级SD怀孕大鼠被随机分为对照组(C,n=36)和试验组(T,n=36)。怀孕第十天起,每天灌胃视黄醇8000 I.U/kg·d(溶解于大豆油),连续灌胃十天;对照组灌胃等体积的大豆油。产后72 h经乳头管灌注LPS 10μg/侧到第四对乳腺(两侧)内。分别于灌注前(定义为O h)及灌注后2、4、8、16和24 h(n=6)颈静脉放血处死动物,采集样品。MPO活力及组织病理学观察显示,视黄醇加快了LPS诱发炎症的组织修复进程,降低PMN在组织中的积聚与持续激活,显著降低LPS灌注后IL-8的释放,降低乳腺组织与血清中NAGase活力,促进细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的优先表达,降低外周血PMN活性氧的释放。试验结果表明,灌胃视黄醇能调节PMN活性,加快PMN的动态迁徙,降低其活性氧的过度释放,对PMN引起的氧化应激具有一定的保护作用。 4大鼠乳腺上皮细胞的优化培养及其炎症反应模型的建立 乳腺上皮细胞是乳腺组织的功能细胞,在受到病原微生物刺激时,乳腺上皮细胞也可产生“自主”抵抗。本研究旨在优化大鼠乳腺上皮细胞培养体系,并建立其炎症反应模型,为进一步深入研究动物乳腺防御机制奠定基础。选择妊娠15-18天的健康SD大鼠,无菌采集乳腺组织,分离大鼠乳腺上皮细胞。结果表明通过胶原酶和透明质酸酶联合消化能成功分离大鼠乳腺上皮细胞,并且在添加了胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、氢化可的松等营养因子的DMEM/F12培养液中生长情况良好。对角蛋白及β-酪蛋白的鉴定结果表明,通过此法分离培养的大鼠乳腺上皮细胞纯度在95%以上,并具备较好的生物学功能。LPS刺激细胞24 h,TNF-α、IL-1p及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA表达均极显著升高,并且LPS刺激浓度在1-10μg/mL范围内呈现剂量依赖效应,由于细胞毒性的作用20μg/mL LPS处理时上述细胞因子的表达有轻微下降,但仍显著高于对照组。10μg/mL LPS刺激显著提高TNF-αIL-1β、一氧化氮(nitric oxide, NO)(?)的释放。结果表明,本试验成功建立了大鼠乳腺上皮细胞原代培养体系及其炎症反应模型。 5视黄醇对试验性诱发的大鼠乳腺上皮细胞炎症反应的调节及机制研究 为进一步研究视黄醇对原代培养的大鼠乳腺上皮细胞炎症反应的调节及机制,分离并原代培养大鼠乳腺上皮细胞,待细胞铺满整个培养瓶的90%,分为对照组和试验组,试验组于基础培养液中添加1μmol/L视黄醇(溶解于DMSO),对照组于基础培养液中添加等量的DMSO,处理24 h后更换培养液,用10μg/mL的LPS处理细胞,分别于不同时间点收集细胞。LPS能显著上调大鼠乳腺上皮细胞TLR-4蛋白水平及NF-κB与DNA的结合活性,而视黄醇处理能显著降低LPS处理后TLR-4蛋白水平,极显著降低NF-κB与DNA的结合活性。LPS处理大鼠乳腺上皮细胞后引起各个时间点炎性因子TNF-α、IL-1β、中性粒细胞趋化因子-1 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1, CINC-1)、iNOS、ICAM-1 mRNA表达极显著的升高,视黄醇能显著下调2.4,8,12h TNF-αmRNA表达,2,4,8hIL-1βmRNA表达及8,12 h iNOS、ICAM-1 mRNA表达,而对CINC-1 mRNA表达无显著影响。试验结果表明,视黄醇预处理通过下调TLR-4/NF-κB信号途径减轻LPS介导的大鼠乳腺上皮细胞的炎症反应。 综上所述,视黄醇能增强大鼠乳腺防御机能,通过下调TLR-4/NF-κB信号途径,抑制中性粒细胞在组织中持续激活,减轻炎性相关因子造成的乳腺组织损伤。本研究证实,视黄醇作为营养免疫生理调节剂在动物乳腺炎防控中有潜在的应用前景。……   
[关键词]:大鼠;乳腺;感染;内毒素;视黄醇;免疫调节
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年