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禽大肠杆菌病的诊断及大肠杆菌的耐药机制研究

Muhammad Yaqoob

  现今全世界范围内医药、土壤中的耐药菌株的出现,已经是个非常严重的问题。抗微生物药在动物疾病预防和生产中的应用大大加剧了细菌耐药性的传播,并且这些耐药菌株有可能通过食物链或者人畜接触从而感染人类。本论文旨在阐述大肠杆菌的耐药特性。 本研究表明耐氨苄西林的菌株同时也表现出来对其他抗生素的耐药,决定此类耐药的基因可能在1类或2类整合子中,或者独立存在。在禽源大肠杆菌中,整合子介导了多重耐药的出现和传播。大肠杆菌的许多耐药基因都是由整合子或质粒携带,通过接合来传递的。但是我们发现,在抗氨苄西林的禽源大肠杆菌中,整合子结构中没有p-内酰胺酶基因,并且通过接合试验也不能将耐药性传递。 大肠杆菌之所以对酰胺醇类抗生素耐药,是因为其含有特异的耐药基因,外排泵过度表达,或者外排泵的调节基因发生突变以及acrR高度表达作用于AcrABC外排泵而导致,就会出现耐酰胺醇的大肠杆菌。通过互补实验证实acrR能显著降低acrA的表达,使菌株的耐药性提高1-4倍。 本实验检测了大肠杆菌对氟喹诺酮类抗菌药的耐药性和gyrA, gyrB和parC基因的QRDR突变情况。实验结果表明多重耐药的大肠杆菌普遍存在氟喹诺酮耐药,DNA测序结果表明gyrA基因双位点突变并伴随parC基因的突变导致菌株对氟喹诺酮类抗菌药的高度耐药。同时在本实验中还检测了氟喹诺酮(FQ)耐药性禽大肠杆菌中拓扑异构酶突变对多重耐药的acrAB泵表达的影响以及质粒携带的氟喹诺酮耐药基因(qnr)。实验中采用了4种氟喹诺酮类药物(环丙沙星,恩氟沙星,氧氟沙星,培氟沙星),8株临床分离的大肠杆菌(其中包括6株氟喹诺酮耐药菌株和2株氟喹诺酮敏感菌株)进行了研究。结果显示(i)对四种氟喹诺酮类抗菌药均耐药的菌株都含有拓扑异构酶位点突变,acrB高度表达,并检测出质粒携带的qnrS和aac(6 )-Ib;(ⅱ)对三种氟喹诺酮类抗菌药(恩氟沙星,氧氟沙星,培氟沙星)耐药的菌株中均含有质粒携带的qnrS基因;(ⅲ)对两种氟喹诺酮类抗菌药(环丙沙星,培氟沙星)耐药的菌株中含有拓扑异构酶突变和质粒携带的qnrS; (ⅳ)所有的氟喹诺酮敏感菌株都没有qnrS基因和拓扑异构酶突变;(ⅴ)除了四种FQs耐药的菌株,其他每组中都有一株菌高度表达acrB基因;(ⅵ)所有菌株中qnrA和qnrB均为阴性。结果表明靶位突变、外排泵高度表达及质粒耐药基因的共同作用导致了大肠杆菌对氟喹诺酮类抗菌药的耐药。质粒携带的qnrS基因介导了大肠杆菌对培氟沙星的抗性,但与氧氟沙星,恩氟沙星,环丙沙星无关。 本实验同时对中国和巴基斯坦分离的大肠杆菌的多药耐药产生的可能机制进行了分析。结果表明大肠杆菌在抗生素的选择性压力下,对β-内酰胺类,四环素和磺胺较为耐药(其)。其耐药机制除对各类药特有的以外。同时,有37.09%的临床分离株都检测到了多耐药性的整合子基因,77%的分离株检测到外排泵acrABC.结果显示:与整合子相比,外排泵基因的高度表达更有利于大肠杆菌多药耐药现象的产生。研究结果还表明大肠杆菌的多重耐药与其遗传性状密切相关。在世界范围内或者邻邦国家之间,多重耐药的大肠杆菌还在不断出现。整合子和外排泵acrABC是介导大肠杆菌多药耐药产生完全不同的两种机制。本研究有助于区别禽源大肠杆菌获得性和先天性耐药,并对大肠杆菌耐药性水平传播的的分子机理进行了探讨。 最后,我们检测了大肠杆菌的多重耐药和毒力基因的关联。结果表明sitA和TspE4C2是大肠杆菌最普遍的毒力基因。与敏感菌株比较,表型为头孢噻肟,四环素和甲氧苄啶抗性的菌株其携带毒力因子的比例有所提高,但氯霉素抗性的菌株携带毒力因子的比例却比敏感菌株低。基因型为Tem, Ctx-M, Tet, Sul 1, dhfr1, Cat2, floR阳性的菌株与毒力基因之间也有相关性。几乎所有的抗性基因都与毒力因子有很好的关联性。与敏感菌株比较,耐药菌株与毒力因子有更多的关联性。在抗性的保护下,细菌可以在体内存活更长的时间,并且不容易被清除掉。……