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捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆、表达与生物学特性研究

易道生

  羊是我国重要的家畜品种,全国各地分布广泛,饲养量居世界第一。由于管理粗放,寄生虫发病率和患病数量巨大,据调查,我国山、绵羊赢患捻转血矛线虫病的比例高达50%-93.85%,给养殖业主造成了巨大的损失,严重影响了养羊业的发展。捻转血矛线虫属毛圆科(Trachostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,寄生于羊的真胃和小肠前段,引起贫血综合症,造成感染羊贫血、消瘦和衰弱,甚至死亡。 丝氨酸蛋白酶抑制因子是天然免疫系统的组成成分之一,属于丝氨酸蛋白酶抑制因子超家族蛋白成员,该家族蛋白参与的反应涉及血液凝固、抑制蛋白酶活性、炎性细胞趋化分泌、黑化、生殖、细胞凋亡、肿瘤转移和信号传导等重要的生理过程。丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制因子在寄生虫感染和免疫应答中具有重要作用,它们彼此协同直接导致病源入侵的信号转导和级联放大,调节体内的生化反应和代谢强度,如血液凝固、蛋白水解和信号传导等。因此,克隆捻转血矛线虫的丝氨酸蛋白酶抑制因子基因并研究其功能,将有助于进一步研究捻转血矛线虫的入侵机制和羊抗捻转血矛线虫的免疫防御机制,丰富和发展抗寄生虫免疫学的内容。 本研究采用cDNA末端快速扩增技术,首次克隆了捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因(hcserpin),并对此基因进行了测序分析和原核表达,利用亲和色谱和排阻色谱技术,获得了纯化重组蛋白HCSERPIN,在此基础上对HCSERPIN的生物学特性做了如下研究: 1.捻转血矛线虫serpin基因的克隆与序列分析 捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子属于丝氨酸蛋白酶的抑制因子超家族蛋白,这类抑制因子引发的级联反应广泛参与寄生虫和宿主间的病理生理过程。为了克隆捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因,本文根据GenBank发表的捻转血矛线虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的EST序列(GenBank登录号为:BM173953,长度536bp),设计并合成特异性引物,分别采用3 -和5 -cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE),获得了该基因的3 -和5 -末端序列。通过序列拼接,得到捻转血矛线虫serpin全基因序列,并将该serpin基因序列递交GenBank确认(确认登录号:FJ888352)。序列分析与比对表明,该基因全长为1317 bp,其5 -末端-2—-22处有一21bp的SL1剪接导引序列。由SL1序列是捻转血矛线虫操纵子结构下游基因的标志分析,标志着下游serpin基因的存在,表明serpin在基因组中以操纵子结构形式存在,且属于该操纵子下游基因。SLl后间隔一个碱基推测的最大开放阅读框长为1104 bp,编码一条367个氨基酸组成的多肽链。该基因与已知serpin核酸序列同源性分别为66-100%。对该序列进一步分析发现,由serpin基因所推测蛋白的367个氨基酸残基有4个N-糖基化位点,11个O-糖基化位点,3个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个肉豆蔻酯酰基化位点,推测其为糖蛋白,其理论等电点和最大分子量(Theoretical pI/Mw)分别为8.5/41016.17道尔顿。Serpin标志序列FEANHPFLFIL位于推测蛋白的344-354氨基酸处,并无信号肽剪切位点。该蛋白与已知Serpins的氨基酸同源性为31-53%。C-端结构域的同源性为29-62%不等。C-端的保守性Serpins超家族基序分别位于RSL1:GTTA 319-322,RSL2:FEANHP 344-349.根据以上的比较与分析,本研究采用RACE克隆的全长cDNA是属于serpin蛋白家族的新基因。 2. HCSERPIN的原核表达与重组蛋白纯化 根据获得的hcserpin基因全长cDNA序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR方法,扩增该全长cDNA序列的最大阅读框,连接于PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,挑阳性质粒测序,选择测序正确的质粒切取目的基因片段,定向克隆于pET32a(+)质粒载体,构建重组表达质粒pET32a(+)-hcserpin。导入大肠杆菌BL21(DE3)表达,用IPTG诱导,获得重组蛋白HCSERPIN,经亲和色谱和排阻层析分离与纯化,获得纯化的rHCSERPIN蛋白;以此rHCSERPIN免疫大鼠,制备多克隆抗体,用Western blotting检测rHCSERPIN免疫原性,以免疫血清检测虫体可溶性蛋白和自然感染H.contortus山羊血液内的HCSERPIN抗体。结果重组质粒经酶切与PCR鉴定,亚克隆的ORF序列与预期的完全一致,定向连接正确,IPTG诱导后,表达产物以包涵体形式存在,经过两次色谱纯化、复性的重组蛋白rHCSERPIN,分量大小约为60.5kD与预期相符,电泳检测为单一条带。ELISA检测表明,rHCSERPIN蛋白具有良好的免疫原性,虫体可溶性蛋白检测可见一条HCSERPIN蛋白带,表明虫体内的HCSERPIN无异构体或聚合体分子存在。同时发现自然感染的山羊血清中存在抗rHCSERPIN蛋白的抗体,说明虫体的HCSERPIN蛋白能够泌出H.contortus细胞外进入山羊组织,引起山羊抗H.contortus的免疫应答。通过蛋白质rHCSERPIN的表达纯化,为捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子的性质、功能和在虫体中的分布等各项研究,奠定了基础。 3. rHCSERPIN抗胰蛋白酶作用及最适反应条件 将复性的重组HCSERPIN蛋白用PBS缓冲液调整到一定的浓度,与一定量的牛trypsin均匀混合,置于37℃水浴孵育,再加入一定量溶于同样缓冲液的牛血清白蛋白作底物,继续孵育一段时间,反应结束通过12%SDS-PAGE变性凝胶电泳法,测定trypsin对底物水解能力的变化。另以BAEE为底物测定trypsin的酶活性抑制率,以及rHCSERPIN抑制活性的最适pH和最适温度。实验结果表明,rHCSERPIN能显著抑制反应管中trypsin活性,抑制率最高达52.3%,抑制后可见SDS-PAGE胶中牛血清白蛋白水解不完全,对照管中的BSA水解完全。rHCSERPIN产生抑制作用的最适pH为7.6,最适反应温度介于37℃—75℃之间。说明本实验表达纯化的rHCSERPIN对trypsin有抑制作用,属于耐热型酶,最适抑制pH为7.6。这些结果将为进一步阐明H.contortus生化特性、致病机理及免疫机理提供科学依据。 4. rHCSERPIN的体外抗凝血试验 通过采用试管法测定纯化rHCSERPIN的体外凝血时间,将rHCSERPIN调整为5ug/ul,0.5 ug/ul和0.05 ug/ul,测定体外抗凝血酶时间和血浆复钙时间,研究大肠杆菌表达纯化后的重组HCSERPIN对凝血系统的作用,所有数据经过Excel2008统计软件进行分析。结果表明, rHCSERPIN能显著延长兔全血的凝固时间,浓度50μg/100μl的rHCSERPIN能将兔全血的凝血时间延长一倍。在给定的剂量实验中,rHCSERPIN能延长抗凝血酶时间和复钙时间(p<0.01),随着蛋白浓度的增加,这种凝固时间也相应延长,呈现出明显的剂量依赖关系。这些结果说明,rHCSERPIN对内源性激活的凝血途径以及外源性凝血过程,均有抑制作用。 5. HCSERPIN在H.contortus体内的分布 新鲜采集的H.contortus成虫经波恩氏液固定,石蜡包埋切片,采用免疫组化的方法研究HCSERPIN蛋白在雌、雄H.contortus成虫体内的分布与表达。结果表明,特异性免疫反应仅出现在H.contortus消化道黏膜上皮细胞,进一步观察发现,这种特异性免疫着色发生在消化道细胞的周围基质或细胞膜上,细胞内并没有出现免疫着色,这也预示着HCSERPIN蛋白在雌、雄性H.contortus体内的表达方式完全一致。由肌肉、皮肤、输卵管和虫卵等部位的组织细胞均没有可见的免疫反应推测,HCSERPIN可能与成虫吸血、血餐消化或黏膜免疫有关,详尽的功能有待今后进一步研究。……   
[关键词]:捻转血矛线虫;丝氨酸蛋白酶抑制因子;基因;蛋白酶抑制活性;抗凝血活性;组织分布
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2011年