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辣椒紫色性状遗传分析、相关基因克隆和种间杂种创制

隋益虎

  紫色辣椒因植株茎、叶、花及未成熟果均富含花青素而呈现紫色,具有耐高温、抗干旱和病毒病等综合抗性特征。花青素及其降解产物在人和动物体内能有效地阻止DNA等大分子物质的氧化损害,具有预防、治疗疾病与身体保健等功能。利用紫色辣椒作为亲本材料,通过与绿色辣椒杂交,实现色素功能互补,提高辣椒营养品质,培育适合夏秋季栽培的专用品种,是解决辣椒生产中“夏淡”的有效途径之一。本文研究了紫色辣椒在夏季环境下坐果及光合特性,分析了紫色性状遗传规律,并利用紫色亲本材料创制了紫色的辣椒种间杂种。主要研究内容与结果如下: 1.紫色辣椒种群归类、夏季坐果率以及光合性能 利用RAPD-PCR技术对来自不同生境类型2份紫色和8份绿色辣椒材料的亲缘关系进行研究,结果表明:从45条RAPD随机引物中筛选出34条引物,共扩增出369清晰条带,其中318条带表现多态性,平均多态性比例为86.2%。聚类分析表明,10份辣椒种质在欧氏距离平方为10.5时,能明显地区分为四大类,其中待测紫色辣椒7033、7036与3份C. annuum代表性材料的遗传相似性最大(0.622-0.732),因此应归为辣椒属的C. annuum种。 为了探索紫色辣椒对高温逆境的耐受性,在夏季塑料日光温室中采用人工蕾期授粉法,对18份紫色和21份绿色辣椒进行自交,并选择其中10份紫色和9份绿色材料做完全随机相互杂交,统计坐果率;选择叶片颜色具有代表性的5个辣椒品种,检测其叶片色素含量、主要光合过程指标和叶绿素荧光参数。结果表明:(1)紫色、绿色辣椒平均自交坐果率分别为72.19%和37.12%;以紫色品种为母本、绿色品种为母本平均杂交坐果率分别为55.99%和21.60%,紫色辣椒自交、杂交坐果率都极显著地高于绿色品种;(2)紫色品种叶片花青素(An)含量、叶绿素a、b比值(Ch1.a/b)都显著高于绿色品种,但Chl.b含量两者无差异;多数紫色品种的Chl.a及类胡萝卜素(Car)含量高于绿色品种的;(3)所有辣椒品种的蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)及Pn日变化趋势一致,呈现双峰曲线,中午前后存在着气孔与非气孔双重限制。紫色品种净光合速率(Pn)达极大值时的光合有效辐射(PAR)、光补偿点(LCP)和光饱和点(LSP)、在一天中的高温时段实际Pn都显著地高于绿色品种,而表观量子效率(AQY)低于绿色品种,说明紫色品种耐强光、高温的能力高于绿色品种;(4)绿色辣椒只在光系统Ⅱ(PSⅡ)的“反应中心水平”减轻过剩能量的伤害,紫色辣椒除此之外还在“天线水平”防止太阳能被原初过多吸收;与绿色品种相比,紫色辣椒7033和7034所吸收(ABS/CS).捕获(TRo/CS)和传递(ETo/CS)的能量总量较低,但同时耗散(DIo/CS)也低,而最大荧光(Fm)、最大光化学效率(Fv/Frm)、潜在光化学效率(Fv/Fo)和电子传递效率(ETo/TRo)等都很高,致使能量在光合膜上传递和利用经济高效。有望通过杂交手段,在辣椒分离世代中选择出具有适中的叶绿素与花青素含量比值,高ABS/CS、Fm、ETo/TRo、Pn值和低F0值的色素功能互补型植株,实现辣椒在高温、强光和低湿下的高光效育种。 2.紫色辣椒叶片色素的提取和花青素含量遗传规律 采用三因素完全随机设计方法研究了紫色辣椒叶片色素的提取条件,结果表明:最佳浸提组合为30℃、0.1 mol·L-1盐酸处理叶片1h。该色素具有水溶性,在可见光区540 nm处有吸收峰。对其稳定性研究表明:直射光、pH值、Fe3+及Ag+显著地降低其稳定;过氧化氢、亚硫酸钠和亚硝酸钠等氧化剂和还原剂对其减色作用显著,抗坏血酸和淀粉等食品添加剂也具有一定的减色作用。 通过构建紫色与绿色辣椒3个杂交组合的6世代群体(P1、P2、F1、B1、B2和F2),用分光光度法测定辣椒叶片花青素相对含量,研究其遗传规律,结果表明:3个杂交组合的分离群体叶片花青素含量呈现出多峰或单峰偏态分布,表现为主基因+多基因的数量遗传特征;通过多世代联合分析表明,辣椒叶片花青素含量遗传模式符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型(E-O模型);F2群体主基因遗传率较高,为78.89%~91.47%,多基因遗传率较低,为5.19%~17.00%。因此对辣椒紫叶性状的遗传选择可在分离早期世代进行。 3.紫色性状的AFLP分子标记和与花青素苷合成相关的基因克隆 基于BSA-AFLP技术,在特紫DNA池中扩增出2条AFLP特异条带E-AC/M-CTC180, E-AC/M-CTC181。对片段进行了回收和测序,序列分析显示,181 bp序列与辣椒C. frutescens栽培种BAC文库的抗烟草花叶病毒病L基因座(FJ597540,FJ597541)、C. annuum栽培种YAC文库的抗细菌性疮痂病的Bs2基因座(AY702979)有76%-83%的同源性;180 bp序列与辣椒C. annuum栽培种BAC文库的长末端重复序列的返转座子部分序列(GU048886)有87%的同源性。 基于RT-PCR技术及同源克隆策略设计引物并克隆了紫色辣椒7033花色苷合成过程的结构基因PAL、CHS、CHI、5GT及调控转录因子R2R3-MYB的部分片段。测序分析表明:获得的这些基因片段长度分别为664 bp、764 bp、579 bp、864 bp和413 bp;紫色辣椒7033的PAL基因片段序列与GenBank中绿色辣椒C. annuum和C. chinense2个栽培种PAL的同源性分别为98%和97%,推测翻译得到的氨基酸序列与前者氨基酸序列完全相同,与后者有2个氨基酸差异;CHS基因片段序列与绿色辣椒C. annuum栽培种相关序列同源性为99%,翻译得到的氨基酸序列与辣椒C. annuum、马铃薯和番茄分别有3、12和12个氨基酸差异;CHI基因片段序列与番茄的PSY 2序列同源性最高为95%,推测有4个氨基酸差异;5GT基因片段序列与番茄、茄子的相关序列同源性均为90%,氨基酸一致性低;R2R3-MYB基因片段序列与已知紫色辣椒C. annuum有99%的同源性,并获得了完全相同的蛋白质序列。为进一步获得参与紫色辣椒花青素苷合成的基因全长及其表达研究奠定了基础。 4.利用胚胎拯救技术创制紫色的辣椒种间杂种(C. annuum×C. chinense) 通过绿色和紫色辣椒正反组合的杂交试验,研究了不同授粉后天数(DAP)及培养基激素浓度对胚胎拯救成功率以及不同配方生根培养基对增殖苗生根的影响,结果表明:在32-34 DAP时能获得胚胎拯救苗,其中MS+8%蔗糖+0.1 mg·L-1GA3+0.05NAA拯救成苗率最高(4.5%~4.84%),其次组合MS+8%蔗糖+0.15 mg·L-1 GA3+0.1NAA也能获得拯救苗(1.43%)。综合分析生根茎段数(率)、生根总数、平均生根数等指标的差异,筛选出实验范围内茎段最适合的生根培养基为1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA。由此建立了克服种间杂交受精后种子败育类型的遗传障碍的胚胎拯救适宜方法。 对采用胚胎拯救技术获得的以紫色材料(C. annuum)为母本、绿色辣椒(C. chinense)为父本的F1杂种植株,进行了杂种真实性鉴定。形态学观察发现,杂种一代植株多数性状特别是器官的紫色介于父母本之间;F1代杂种的细胞学研究表明,花粉母细胞减数分裂期染色体的行为发生异常,可育性花粉的比例显著地低于相应的父母本;过氧化物同工酶谱带及RAPD标记分析显示,F1杂种具有部分特异的父本条带;直接测序方法得到的核糖体DNA转录间隔区(ITS)序列表明,与其父母本序列相比较,F1杂种存在186个变异位点,其中139个位点(74.7%)继承了父本序列,23个位点(12.4%)继承了母本序列,其余为碱基颠换/转换。从而由形态学、细胞学、同工酶学及分子生物学等方面的一致性证明了所获得F1杂种植株为真实的种间杂种。……   
[关键词]:紫色辣椒;花青素;遗传;分子标记;基因克隆;同源性;坐果率;光合特性;胚胎拯救;种间杂种
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2011年