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山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究

于淼

  近年来,我国新城疫(Newcastle disease, ND)的流行日益复杂,免疫失败屡屡发生,给养禽业,特别是养鸡业造成了不可估量的经济损失。为更好地防制新城疫的发生,探索有效的防制措施,本研究对山东省鸡新城疫进行了流行病学调查,掌握了新城疫的流行状况,并分离获得了12个新城疫病毒流行株。在此基础上,对新城疫病毒LY1分离毒株的致病性及变异性状开展了检测分析,然后以此分离株制备灭活疫苗进行免疫保护试验,同时,构建了新城疫病毒HN基因C3dP29补体融合基因疫苗,探明了C3d P29基因的分子佐剂效果,为新城疫防制奠定了重要基础。主要研究包括以下4个部分: 1.NDV的分离鉴定与生物学特性研究 从山东省8个地区22个养禽场82份疑似新城疫病料中,分离和鉴定出12株NDV。将12株NDV进行了MDT、ICPI和IVPI检测,结果表明,6个分离株(WF10、WF13、LY1、LY7、ZB10和JN2株)MDT均小于60h、ICPI均大于1.6、IVPI均在2.00以上,表明为强毒株;DY2、LC3和BZ7株的MDT分别为63.6h、69.6h和62.4h, ICPI值为1.4、1.44和1.35,IVPI值为1.74、1.85和1.49,为中毒力毒株;WF3、LY14和TA6株为弱毒株。经动物回归试验,各毒株NDV均可导致鸡发生不同程度的发病和死亡,且发病和死亡的鸡均出现ND典型症状和剖检变化。 2. NDV LY1株F和HN基因的克隆与序列分析 利用RT-PCR技术,对山东省新城疫病毒LY1分离株的F基因主要功能区片断和HN基因全部的核苷酸序列进行了克隆和序列分析。结果显示:(1)LY1株F基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp,编码489个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,该毒株F基因核苷酸序列的同源性在84.1%~88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%~93.3%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致。从分子水平证明NDV山东分离株(LY1)为新城疫强毒株。LY1株病毒在101位和121位分别为K(赖氨酸)、V(缬氨酸)两种特征氨基酸,具有Ⅶ型基因型NDV的典型特征。该毒株与我国标准毒株的同源性较低,与强毒株F48E9的同源性只有86.3%,与新城疫标准弱毒株C30的同源性只有84.2%,说明已发生一定的变异,这可能是高抗体水平压力下引起鸡群发病的原因。(2)HN基因ORF大小为1716bp,编码571个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%~87.4%之间,氨基酸同源性在87.6%~90.9%之间,属于强毒的C群,这与该病毒生物学鉴定的结论是一致的。 3.新城疫病毒不同基因型灭活油乳疫苗的研制及免疫效果测定 将新城疫病毒基因Ⅶ型LY1分离株和传统的LaSota株(基因Ⅱ型)与油佐剂按1:3比例混合乳化,分别制成油包水型LY1分离株、LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗;无菌试验和物理性状检验合格;鸡体倍量注射试验结果证明疫苗安全性好;用LaSota株抗原进行HI试验,检测免疫接种鸡抗NDV-HI抗体,结果显示,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗于接种后的14d、21d、28d所产生的平均HI抗体效价与商品化灭活疫苗(LaSota株)无明显差异(P>0.05),至35d后两种疫苗的抗体效价均达到7.2Log2以上;而LY1分离株灭活疫苗组各个时期(接种后7天除外)所产生的平均HI抗体效价与LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组及商品化灭活疫苗(LaSota株)组的抗体效价差异显著(P<0.05)。LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组、LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗(LaSota株)组HI抗体效价上升规律相同,均与对照组各个时段所产生的平均HI抗体效价差异均极显著(P<0.01)。免疫后4周用LY1分离株进行了攻毒试验。结果证明,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组免疫保护率可达100%,LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗(LaSota株)组的免疫保护率分别为90%和70%。表明单纯使用LaSota株商品化灭活疫苗产生的保护力较低,而用分离株配以LaSota株制备的不同基因型(基因Ⅱ型+基因Ⅶ型)灭活油乳疫苗则能产生较强的保护能力。 4.鸡C3d分子佐剂-NDVHN基因疫苗的构建与免疫保护效果研究 以RT-PCR扩增新城疫病毒LY1株的HN基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29n中P29n的上游,将鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂与新城疫病毒的HN基因连接,构建了NDVpCDNA-HN-P29.4和pCDNA-HN-P29.6分子佐剂基因疫苗,免疫接种3周龄SPF鸡,结果显示,免疫后3-4周pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6和pCDNA-HN免疫组均能诱导鸡体产生HI抗体,但pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6免疫组HI抗体水平明显高于pCDNA-HN免疫组(P<0.01),但低于商品化灭活苗免疫组。攻毒试验结果表明,pCDNA-HN-P29.6和商品化灭活苗免疫组能够较好地抵抗致死量病毒的攻击,保护效率达90%,明显高于pCDNA-HN免疫组,表明鸡C3d分子对NDV-HN基因具有明显协同作用。该研究结果为进一步研究开发和利用鸡C3d奠定了基础。……   
[关键词]:新城疫病毒;分离鉴定;分子特征;灭活疫苗;C3d
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2009年