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荧光假单胞菌7-14生物膜突变株的筛选及tatC基因的克隆与功能初析

康越景

  利用mariner转座子对荧光假单胞菌7-14(Pseudomonas fluorescens 7-14, Pf7-14)进行转座诱变,成功构建了Pf7-14的突变体文库。利用96孔板筛选法,从8500多株突变体中筛选得到一株生物膜增强突变株4B5和一株生物膜减弱突变株25C11。通过任意PCR (arbitrary polymerase amplification reacrion, arbitrary PCR)和亚克隆技术鉴定出,4B5的转座子插入的位点与P. fluorescens Pf0-1编码chemotaxis sensory transducer的基因,与P. fluorescens Pf-5编码methyl-accepting chemotaxis transducer的基因具有很高的同源性,25C11的转座子插入的位点与P. fluorescens Pf-5和Pf0-1的编码lipoyltransferase的基因lipB高度同源。根据Pf0-1和Pf-5相关基因的序列设计简并引物,从Pf7-14中扩增出了对应的基因。油菜离体叶片的菌体分布试验表明,和Pf7-14野生型相比,4B5在油菜叶片上粘附的细胞数量较多,25C11粘附的细胞数量较少。 根据荧光假单胞菌Pf-5和SBW25的tatC基因序列设计简并引物,采用PCR方法从Pf7-14中克隆了tatC基因,命名为tatCPf7-14。通过序列分析,我们比较了tatCPf7-14与同种、同属和其它相关细菌中tatC基因的核酸序列的同源性,以及TatCPf7-14与这些细菌中TatC蛋白的氨基酸序列的同源性。通过同源重组单交换的方法,构建了Pf7-14 tatC基因的插入突变株。研究发现,(1)tatC突变株的蛋白酶、嗜铁素的产量较野生型有所降低;(2)tatC突变体的游动能力和生物膜形成能力均弱于野生型。互补菌株均恢复了上述性状。tatC基因的突变未改变Pf7-14在LB培养基中的生长速率。平板拮抗试验显示,突变体对主要病原真菌仍具有很好的拮抗能力。……   
[关键词]:转座诱变;生物膜;基因克隆;tatC基因;同源重组;功能分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年