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拯救GPMV毒株细胞系的构建及靶向沉默P基因抑制GPMV复制研究

母连志

  鹅副黏病毒病是由鹅副黏病毒引起的一种高死亡率的传染病。该病对各种年龄的鹅均具有易感性,其中15日龄以内雏鹅的发病率和死亡率可高达100%。经鉴定,鹅副黏病毒为禽副黏病毒血清I型,因此鹅副黏病毒病又可称为是鹅的新城疫。近几年,该病对我国养鹅业造成了严重的经济损失,威胁着养鹅业的健康发展。鹅副黏病毒病的预防主要依靠弱毒疫苗株,目前尚没有同源疫苗进行鹅副粘病毒病的特异免疫,因此,新型疫苗的创制是该病防控的重要环节之一。通过反向遗传学技术来获得鹅新城疫的疫苗株是国内外研究的热点,其中最重要的基础环节就是需要一个稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系。 新城疫病毒的复制主要依靠核糖核蛋白聚合体(RNP),形成RNP的必要条件之一就是需要P蛋白,P蛋白和L蛋白的结合物具有RNA依赖RNA聚合酶活性,所以本研究选择靶向沉默P基因,进而抑制病毒的复制。 对T7RNA聚合酶基因进行克隆,构建真核表达载体PCI-T7。利用脂质体转染法将该载体转染到V7细胞系,构建了表达T7 RNA聚合酶的V7细胞系。并利用Western blot和间接免疫荧光对HA蛋白进行了检测,证实T7 RNA聚合酶基因在VT7细胞系中得到了稳定有效的表达。 根据鹅源副黏病毒NA-1株已发表的P基因序列,siRNA表达载体的要求和RNAi靶位基因序列选择原则,应用BLAST工具筛选出特异性地针对鹅源副黏病毒的siRNA序列,同时设计阴性RNAi靶位。根据所设计的RNAi的靶位分子和表达载体的要求,将RNAi靶位分子经过退火、纯化后连接到酶切后的RNAi专用表达载体上,进而转染鸡胚成纤维细胞(CEF)及鸡胚,6h后接种病毒。接毒后36h时分别用Real Time RT-PCR、病毒滴度测定、间接免疫荧光、细胞病变情况来观察RNAi对GPMV NA-1在CEF中复制和繁殖的影响情况,并用血凝试验检测RNAi在鸡胚中的抑制作用。实验结果显示,针对GPMV NA-1株P基因设计的2个RNAi靶位,在RNAi过程中表现出了很强的抑制效果,其中RNAi-P641的抑制效率更高。说明了P基因的这两个位点是鹅源副黏病毒复制所必需的。 脱氧核酶(Deoxyriozyme DNAzyme DZ)是一种通过对体外合成的随机序列库进行筛选得到的具有RNA切割功能的DNA分子,是目前基因沉默研究的热点之一。本试验应用生物信息学针对鹅源副黏病毒NA-1株P基因设计DZ-P-358、DZ-P-446、DZ-P-7023种10-23脱氧核酶,经体外切割实验筛选得到DZ-P-702、DZ-P-358具有切割活性,DZ-P-702活性较高。在CEF细胞水平通过细胞病变情况、病毒滴度测定、间接免疫荧光方法验证了DZ-P-702、DZ-P-358可以抑制鹅源副黏病毒在CEF细胞的复制;通过Real-time PCR方法检测表明DZ-P-358及DZ-P-702降低CEF细胞中P基因的转录水平,其中DZ-P-702抑制效率可达到78.5%。通过对尿囊液血凝效价的测定表明脱氧核酶可以有效抑制GPMV在鸡胚中的增殖,展现了脱氧核酶在生产实践中的应用前景。 综上所述,本研究成功构建稳定表达T7RNA聚合酶的VT7细胞系,为通过反向遗传学技术来获得新城疫的疫苗株奠定了坚实的基础;筛选出两个有效的抑制鹅副黏病毒P基因表达的干扰靶位。筛选出了针对鹅副黏病毒P基因特异的脱氧核酶DZ-P-702。有效靶位的筛选和确立,为进一步研究该病的抗病毒治疗及抗病育种领域提供了技术基础。……   
[关键词]:T7RNA聚合酶;鹅副黏病毒;RNA干扰;脱氧核酶
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2011年