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毛细管电泳在药物筛选中的应用和技术开发

张勃

  毛细管电泳是一种高效、快速、微量的分离分析技术,在生物分析领域应用广泛。本文利用毛细管电泳的技术特点将其应用于药物筛选中,针对药物活性筛选中的关键技术问题,如高效快速的筛选方法和新药物靶点寻找,进行了一系列的新探索。 首先,药物活性筛选新方法的开发。对化合物进行活性筛选,主要是研究化合物与药物靶点的相互作用。亲和毛细管电泳是研究分子间相互作用的常用方法,以待测样品的有效电泳淌度为参数计算分子间的结合常数。淌度的准确测定是该方法的重要前提,但是由于受到温度变化、电渗流波动等因素的影响,重现性较差,限制了其发展。本文在上述技术的基础上,开发了一种压力驱动的亲和毛细管电泳方法,通过将气压推动过程和电泳过程相结合,有效的避免了因素的干扰,分析时间也大大缩短。采用该方法研究了8种具有不同pKa值、不同结合能力的药物与牛血清白蛋白之间的结合情况,并计算了结合常数值。通过与传统的荧光分光光度法的测定结果比较,验证了该方法的可行性和准确性。同时,明确了该方法适用于研究结合较弱的反应体系。 其次,药物结构筛选模型的建立。活性筛选是目前常用的筛选方法,但是因筛选指标单一,筛选结果具有误导性,单纯的增加筛选数量难以找到有活性又未知的化合物,因此筛选成本高,效率低。为此,本文探索了一种全新的结构筛选方法,以抗原特殊结构为核心,利用抗原和抗体特异性识别能力,筛选具有抗原类似结构的化合物。以抗真菌药物棘球白素B的母核和其多克隆抗体为样品,采用毛细管电泳配体分离法和激光诱导荧光检测技术,通过研究二者的结合行为,初步建立了以抗原有效电泳淌度变化为判断依据的结构筛选模型。该模型旨在用于筛选具有潜在抗真菌活性的化合物。 最后,药物靶点发现方面的应用。差异蛋白质组学是发现药物作用靶点的重要方法,二维凝胶电泳和质谱是分离和鉴定蛋白质的核心技术。经二维凝胶电泳分离的蛋白质,在进入质谱之前需要长时间、繁琐的样品处理过程,难以满足自动化的需要。针对该问题,本文在前人工作的基础上,开发出一种集凝胶中蛋白质转移和在线酶解的毛细管电泳方法。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的牛血清白蛋白条带为研究对象,采用三电极的转移模式,将蛋白质高效、快速的从凝胶中转移到毛细管中。采用溶胶-凝胶技术制备固定胰蛋白酶的毛细管整体柱,通过与转移毛细管相连,实现了转移出来蛋白质的在线酶解和检测。该技术的开发大大提高了转移效率,为二维凝胶电泳和质谱提供了一个有效的连接手段。……   
[关键词]:毛细管电泳;药物筛选;结合常数;抗原抗体反应;SDS-聚丙烯酰胺凝胶;蛋白质转移;固定酶整体柱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津大学2012年